顯脈金花茶葉片中山奈酚的提取分離及含量測定

陳秋虹 劉鵬 韋英亮 劉布鳴 黃艷 莫建光

摘要：利用溶劑提取法對顯脈金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）干燥葉乙酸乙酯部位提取分離，并測定其含量。結(jié)果表明，從顯脈金花茶葉片中乙酸乙酯部位首次分離得到化合物山奈酚（kaempferol）;建立了HPLC法對顯脈金花茶葉中山奈酚的含量測定方法，山奈酚含量在0.10～0.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為99.84%（RSD=1.59%），山奈酚含量為0.318 2～0.364 0 mg/g。

關(guān)鍵詞：顯脈金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）;山奈酚;含量測定

中圖分類號：R284.1;R282.71? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）14-0156-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.14.032 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Solvent extraction method was used to extract and separate the ethyl acetate part of dried leaves of Camellia euphlebia Merr.ex Sealy， and determine its content. The results showed that the compound kaempferol was first isolated from the ethyl acetate part of Camellia euphlebia Merr.ex Sealy; the content determination method of kaempferol in Camellia euphlebia Merr.ex Sealy was established by HPLC. The kaempferol ranged from 0.10 to 0.40 μg/mL. The internal linear relationship was good， the average recovery rate was 99.84% （RSD=1.59%）， and the measured content of kaempferol was 0.318 2～0.364 0 mg/g.

Key words： Camellia euphlebia Merr. ex Sealy;kaempferol;content determination

金花茶（Camellia nitidissima C. W. Chi）是山茶科山茶屬金花茶組金花茶系植物[2]，因其具有清熱解毒、利尿利濕、止痢止血等功效而被廣泛應(yīng)用[1-3]。大量的臨床試驗(yàn)證明，金花茶具有降血糖、降血壓、降血脂[4-6]、降血清中膽固醇、抑制腫瘤生長[7，8]、防止動脈粥樣硬化、激活人體多種酶、提高肌體免疫能力、延緩衰老抗氧化等作用[9-11]。目前，廣西壯族自治區(qū)防城港市建立了世界惟一的國家級野生金花茶自然保護(hù)區(qū)，并建立起了該物種基因庫，防城港市金花茶組植物主要類型有普通金花茶（Camellia nitidissima）、東興金花茶（C.tunghinensis）、顯脈金花茶（C. euphlebia Merr.ex Sealy）及長柱金花茶（C. nitidissima var. longistyla）。

有關(guān)金花茶化學(xué)成分研究尚處于初步階段，而顯脈金花茶作為其中一個(gè)品種在分析測定方法中尚未有文獻(xiàn)進(jìn)行研究報(bào)道，本研究通過采用現(xiàn)代溶劑提取分離和各種柱色譜方法、波譜技術(shù)（UV、TLC、IR、1H-NMR、13C-NMR）等方法首次分離鑒定顯脈金花茶葉片中活性成分——山奈酚，并建立了HPLC法測定顯脈金花茶葉片中山奈酚含量的方法，該法操作簡便可行、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為顯脈金花茶葉片中山奈酚的含量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 顯脈金花茶干燥葉，采集于廣西壯族自治區(qū)防城港市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院中藥研究所賴茂祥研究員鑒定為顯脈金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）。

1.1.2 儀器 Thermo TSQ QUANTUM ACCESS液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）;CAMAG TLC SCANNER薄層色譜掃描儀（瑞士卡瑪公司）;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化儀器廠）;LC-10AT型高效液相色譜儀配SPD-10A型紫外檢測器（日本SHIMADZU公司）;YRT-3型熔點(diǎn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）;UV 2550 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）;METTLER-XS205 分析天平（瑞士METTLER公司）;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;HH-S恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）;KQ5200B型超聲波儀（160 W、40 kHz，江蘇昆山市超聲儀器有限公司），各種不同規(guī)格口徑的普通玻璃層析柱。

1.1.3 試劑 柱層析硅膠（100～200目）、薄層層系硅膠（硅膠G）（青島海洋化工廠）;乙腈（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）;濃硫酸、冰醋酸、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、丙酮、磷酸、甲醇（均為中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純），乙醇為工業(yè)純;水為超凈水。

山奈酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用），純度>98%。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)成分的提取與分離 取曬干顯脈金花茶葉片10 kg，用95%乙醇溶液加熱回流3 h，提取2次。合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮液再水浴揮干至無醇味，干燥后得到無水乙醇總浸膏。

取出顯脈金花茶葉片總浸膏加水混懸，依次用石油醚（沸程60～90 ℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮后，不同步驟萃取后得到產(chǎn)物各122.0、46.0、18.0、79.0 g。取經(jīng)乙酸乙酯萃取后的產(chǎn)物18.0 g經(jīng)硅膠柱色譜（360.0 g，200～300目）分離，石油醚-乙酸乙酯（100∶0→100∶1→80∶1→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→0∶100）梯度洗脫，在石油醚-乙酸乙酯（5∶1，V/V）得到粗粉末，以氯仿-甲醇-冰醋酸（75∶15∶1，V/V）為洗脫劑反復(fù)硅膠柱層析，得到化合物Ⅰ（14 mg）。

1.2.2 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅰ：黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)276～278 ℃，溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮，不溶于石油醚、水。365 nm處紫外光下顯黃綠色熒光，有拖尾現(xiàn)象，加酸后，該現(xiàn)象消失，噴三氯化鋁溶液熒光增強(qiáng)顯黃綠色單斑。其碳譜數(shù)據(jù)（表1）與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的山奈酚基本一致，因此化合物Ⅰ確定為山奈酚（kaempferol）。

1.2.3 化合物Ⅰ——山奈酚的定量分析

1）對照品溶液的制備。精密稱定山奈酚對照品10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，制得每1 mL含1 mg的山奈酚儲備溶液，取? ?1 mL山奈酚對照品儲備液，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含有山奈酚100 μg的山奈酚對照品溶液。

2）供試品溶液的制備。精密稱定顯脈金花茶葉干燥粉末1.0 g，加入甲醇-25%鹽酸（4∶1）混合溶液25 mL，稱定重量，加熱回流100 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

3）色譜條件的確定。色譜柱為Ultimate XB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流動相為乙腈∶0.2%磷酸水溶液=32∶68;流速為1.0 mL/min;檢測波長為360 nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取100 μg/mL的山奈酚對照品0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液補(bǔ)足至刻度，搖勻，配成系列濃度的對照品溶液，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以山奈酚含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=76 568.6x-23 137.9，r=0.999 7，表明山奈酚含量在0.10～0.40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 精密度考察

分別精密吸取20 μL對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，RSD分別為1.61%、1.69%，表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性考察

精密稱取顯脈金花茶干葉粉末1.0 g，制備供試品溶液后進(jìn)行試驗(yàn)，12 h內(nèi)每間隔2 h進(jìn)樣，山奈酚峰面積RSD為1.72%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性考察

精密稱取顯脈金花茶干燥葉粉末1.0 g，制備6份供試品溶液進(jìn)行試驗(yàn)測定。結(jié)果表明，山奈酚平均含量為0.381 mg/g，RSD為2.27%。

2.5 回收率考察

精密稱定6份已知山奈酚含量的顯脈金花茶干燥葉粉末0.5 g，置于平底燒瓶中，加入1.8 mL 100 μg/mL的山奈酚，制備供試品溶液。結(jié)果表明，山奈酚平均回收率為99.84%，RSD為1.59%（表2）。

2.6 樣品測定結(jié)果

精密稱取3批次顯脈金花茶干燥粉末各1.0 g，制備供試品溶液后進(jìn)行試驗(yàn)，測定山奈酚的含量，結(jié)果見表3。

3 小結(jié)

本研究采用現(xiàn)代分離方法對顯脈金花茶葉片乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離，首次從該品種植物中分離鑒定得到山奈酚。山奈酚屬于黃酮醇類化合物，黃酮類成分有良好的抗氧化、抗腫瘤等藥理活性。以山奈酚對照品作為對照，建立了顯脈金花茶干燥葉中測定山奈酚含量的HPLC法，并測定了3批樣品中的含量，測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于顯脈金花茶的質(zhì)量控制，為其多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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