雷公藤內(nèi)酯醇保護脂多糖誘導(dǎo)足細胞損傷的體外研究

齊芳艷 劉俊朝 俞 建△ 徐 虹 韓新利 汪永紅 孫 雯

（1復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院中醫(yī)科，2腎臟科 上海 201102）

足細胞又稱為腎小球內(nèi)臟上皮細胞，是高度特化的、終末分化的上皮細胞［1］，參與構(gòu)成腎小球濾過屏障，在腎小球濾過功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［2］。具有大量足突是足細胞的顯著特點，這一結(jié)構(gòu)的維系由細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架承擔(dān)［3］，相鄰足細胞之間的足突可互相交叉重疊形成裂孔隔膜（the slit diaphragm，SD）。各種病理因素可導(dǎo)致足細胞損傷，使細胞骨架發(fā)生重排，出現(xiàn)廣泛的足突融合［4］，這是臨床上產(chǎn)生蛋白尿的重要基礎(chǔ)。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是脂質(zhì)A 與革蘭陰性細菌細胞壁寡糖的復(fù)合物，其誘導(dǎo)的足細胞損傷模型被廣泛應(yīng)用于腎臟疾病研究［5-6］。LPS 主要通過NFκB 信號通路導(dǎo)致足突融合及細胞骨架改變，從而造成足細胞損傷［5］。

中醫(yī)藥用于腎臟疾病的治療已有數(shù)千年歷史，雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TPL）［7］是中草藥雷公藤的主要活性成分之一，TPL 生物學(xué)作用包括免疫抑制、抗炎、抗癌等［8-11］。TPL 可提高Nephrin 等足細胞保護性蛋白的表達，從而對嘌呤霉素氨基核苷（purinomycin aminophenol，PAN）誘導(dǎo)的足細胞損傷模型起保護作用［12-13］。

經(jīng)典足細胞損傷模型中，可出現(xiàn)足細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)分子表達降低，如CD2-相關(guān)蛋白（CD2-associated protein，CD2AP） 、突 觸 極 蛋 白（Synaptopodin）、Palladin、黏著斑蛋白（Vinculin）等。CD2AP 表達于SD，可與Nephrin、Podocin 結(jié)合［14］，SH3-1 結(jié)構(gòu)域Y10 位的酪氨酸磷酸化過程對其與Nephrin 的結(jié)合起關(guān)鍵作用［15］。Lehtonen 等［16］的研究證明，CD2AP 與足細胞細胞骨架肌動蛋白密切相關(guān)，可參與維持細胞骨架穩(wěn)定。Synaptopodin 是一種富含脯氨酸的肌動蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)分子，參與調(diào)控足細胞足突的肌動蛋白形態(tài)及其運動［17］。Palladin 在參與穩(wěn)定細胞骨架和維持黏著斑功能中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［18］。Artelt 等［19］研究表明，足細胞中Palladin 與細胞骨架關(guān)系密切，其表達降低可引起足細胞肌動蛋白絲形成減少以及肌動蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)分子的表達異常。Vinculin 是主要定位于黏著 斑 的銜接 蛋 白 質(zhì) 分子［20］，Lausecker 等［21］研 究表明，Vinculin 參與維系足細胞足突結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定細胞間連接，維持腎小球濾過屏障功能完整，并參與調(diào)節(jié)腎小球濾過作用。 血管生成素樣蛋白3（angiopoietin-like protein 3，Angptl3）基 因 最 早 由Conklin 等［22］發(fā)現(xiàn)，生理情況下主要表達于肝臟，腎臟表達微弱，參與脂質(zhì)代謝［23］。實驗證明，Angptl3 可介導(dǎo)足細胞損傷［24-26］。上述蛋白質(zhì)分子與足細胞細胞骨架構(gòu)成及功能維持均有一定關(guān)系，其表達水平的高低可在一定程度上反映對細胞骨架的影響程度。

因此，我們利用TPL 處理LPS 誘導(dǎo)的足細胞損傷模型，通過觀察細胞骨架變化及檢測不同處理組足細胞CD2AP、Synaptopodin、Palladin、Vinculin 以及Angptl3 的表達變化，從而探討TPL 是否對足細胞細胞骨架具有保護作用。

材料和方法

細胞培養(yǎng)小鼠條件永生化足細胞株（MPC5），由美國Peter Mundel教授構(gòu)建、浙江大學(xué)毛建華教授轉(zhuǎn)贈。培養(yǎng)方法參考文獻［27］，MPC5 復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素、10 IU/mL γ-IFN 的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），于33 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化時，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，加入不含γ-IFN的1640 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；分化14 天時，用0.25%Trypsin-EDTA（美國Gibco 公司）消化傳代培養(yǎng)足細胞，細胞匯合達80%時進行干預(yù)實驗。LPS（美國Sigma 公司）誘導(dǎo)足細胞損傷，根據(jù)給予或不給予TPL（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司），檢測純度99.03%）處理24 h，分為空白對照組（生理鹽水）、藥物組（TPL 3 ng/mL）、模型組（LPS 25 μg/mL）及實驗組（LPS 25 μg/mL+TPL3 ng/mL）。藥物作用濃度的選擇參考文獻［12］，由前期預(yù)實驗確定最終濃度，結(jié)果未展示。

Western blot 檢測將收集的細胞溶解于含有蛋白酶抑制劑PMSF 的RIPA 緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）中，冰上裂解后4 ℃11 000×g離心取上清，加入加樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）100 ℃加熱10 min，確定蛋白上樣量，配制8%分離膠、濃縮膠，Marker，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)目的蛋白分子量裁剪條帶，5%脫脂奶粉封閉30 min，TBST 洗膜，加入針對Angptl3、Synaptopodin、CD2AP、Palladin 和GAPDH 的 一抗在4 ℃孵育過夜，洗膜后使用山羊抗兔IgG-HRP 二抗60 min，洗膜10 min×3 次，顯色、曝光（Tanon-5200）。將蛋白質(zhì)表達標準化為GAPDH 作為管家蛋白質(zhì)。

足細胞細胞骨架觀察藥物處理24 h，預(yù)冷的PBS 清 洗，4% 多 聚 甲 醛 室 溫 固 定10 min，0.2%Triton-X 100 PBS 室 溫 破 膜10 min，PBS 洗 片 后加入50 μg/mL 的FITC 標記的鬼筆環(huán)肽（美國Sigma公司），室溫避光孵育40 min，PBS 清洗后加入DAPI 染液，室溫避光孵育20 min，PBS 清洗2 次，抗淬滅封片劑封片，玻片于激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）下觀察并采集圖像

足細胞免疫熒光藥物處理24 h，預(yù)冷的PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.2% Triton-X 100 PBS 室 溫 破 膜10 min，PBS 洗 片 后 加 入3%BSA-PBS 室溫封閉30 min，加入3%BSA-PBS配制的Vinculin 一抗4 ℃孵育過夜，PBS 清洗后加入FITC 標記的熒光二抗及DAPI 染液，室溫避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，抗淬滅封片劑封片，于激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）下觀察并采集圖像。

統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。每個實驗至少重復(fù)3 次。

結(jié) 果

TPL 對足細胞細胞骨架的影響足細胞骨架重排是檢測足細胞功能的重要指標之一，因此我們檢測了各組的細胞骨架情況。如圖1 所示，通過免疫熒光染色觀察不同處理組細胞骨架排列情況，藥物組與空白對照組無明顯差異，模型組足細胞細胞骨架呈短棒狀無序排列，甚至正常的絲狀結(jié)構(gòu)消失，細胞形態(tài)改變較為明顯，而實驗組可見足細胞細胞骨架排列趨于整齊，部分絲狀結(jié)構(gòu)完整。

TPL 對足細胞CD2AP 和Synaptopodin 表 達的影響應(yīng)用Western blot 分別檢測空白對照組、藥物組、模型組及實驗組足細胞CD2AP 和Synaptopodin的表達情況（圖2）。與空白對照組相比，藥物組CD2AP 及Synaptopodin 表達無明顯差異，模型組表達明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，實驗組足細胞CD2AP（P<0.05）及Synaptopodin（P<0.001）的表達明顯增高。

TPL 對足細胞Palladin 及Angptl3 表達 的 影 響應(yīng)用Western blot 分別檢測空白對照組、藥物組、模型組及實驗組足細胞Palladin 及Angptl3 的表達情況（圖2）。與空白對照組相比，藥物組Palladin 表達無明顯差異，模型組足細胞Palladin 表達明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，實驗組Palladin 的表達明顯增高（P<0.05）。與空白對照組相比，藥物組Angptl3 表達無明顯差異，模型組Angptl3 的表達明顯增高（P<0.001）；與模型組相比，實驗組Angptl3的表達明顯降低（P<0.05）。

TPL 對足細胞黏著斑蛋白Vinculin 表達的影響足細胞失黏附是其功能損傷的另一個重要表現(xiàn)，黏著斑蛋白Vinculin 的表達情況可以反映足細胞的黏附功能。應(yīng)用免疫熒光法檢測不同組Vinculin 的表達情況（圖3）。與空白對照組相比，藥物組Vinculin 表達無明顯降低，模型組的Vinculin 表達明顯降低；與模型組相比，實驗組Vinculin 表達相對較高。

討 論

足細胞足突融合是產(chǎn)生蛋白尿的重要病理生理基礎(chǔ)之一，與足細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)損傷及細胞-細胞連接缺失密切相關(guān)［28-29］。CD2AP 作為足細胞重要的固有蛋白質(zhì)分子之一［30］，與足細胞細胞骨架的維系關(guān)系密切［16］；Synaptopodin 在參與調(diào)節(jié)足細胞骨架重排及足細胞的運動過程中發(fā)揮重要的作用［17，31］，Huber 等［32］研 究 表 明，Synaptopodin 與CD2AP 之間有直接的相互作用。本實驗探究TPL對LPS 誘導(dǎo)的足細胞損傷模型的保護作用，藥物作用濃度參考Zheng 等［12］的研究，最終濃度由前期預(yù)實驗確定，研究結(jié)果提示TPL 可緩解LPS 誘導(dǎo)的足細胞骨架損傷，保持足細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)的相對完整，并使足細胞CD2AP、Synaptopodin 的表達增高，所以我們認為TPL 對足細胞骨架的保護作用與其使CD2AP 和Synaptopodin 的表達增高有一定的關(guān)系。

Artelt 等［19］研究提示，Palladin 的表達降低與肌動蛋白纖維的減少有關(guān)，同時也與足細胞特異性的肌動蛋白結(jié)合蛋白Synaptopodin 和α-actinin-4 的表達降低有關(guān)。Atherton 等［33］的研究表明，Vinculin 在整合素介導(dǎo)的肌動蛋白絲與細胞外基質(zhì)的連接中發(fā)揮重要作用，有研究證明［34-35］Vinculin 對維持足突正常結(jié)構(gòu)十分重要；Palladin 對足細胞的影響可能與Vinculin 有 關(guān)［19］。我 們 的 研 究 證 明，TPL 不 僅 可 以減輕LPS 造成的足細胞Palladin 表達降低，同時可以有效保護Vinculin 的表達。Palladin 及Vinculin 的表達增高與保護足細胞細胞骨架結(jié)構(gòu)完整性有一定的關(guān)系，但TPL 與上述兩種蛋白質(zhì)分子的表達有無直接聯(lián)系，尚需進一步試驗證明。

徐虹課題組對Angptl3 基因在腎臟疾病中的作用做了大量研究。在足細胞損害嚴重的病理類型中，如微小病變型腎病（minimal change disease，MCD）和膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）腎臟組織中Angptl3 的表達明顯增高［36］。腎病損傷動物模型中Angptl3 主要在腎小球足細胞足突部位表達增高［37］。進一步的體外研究表明，Angptl3 可與足細胞表面的整合素αVβ3 結(jié)合，最終通過αVβ3/FAK/PI3K 信號通路導(dǎo)致足細胞骨架重排和足細胞遷移增加［25］。最新研究表明，抗ANGPTL3-CCD抗體可以改善小鼠阿霉素模型中的蛋白尿及足細胞功能損傷［38］。本研究中，空白對照組及藥物組足細胞Angptl3 幾乎不表達，模型組中Angptl3 的表達明顯增高，實驗組Angptl3 的表達顯著降低，說明TPL 可以降低足細胞Angptl3 的表達。目前尚無關(guān)于通過降低Angptl3 的表達而保護足細胞藥物的報道，我們推測TPL 對足細胞的保護與影響Angptl3的表達可能有一定的聯(lián)系。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療腎病歷史悠久，雷公藤在腎臟疾病及免疫性疾病的治療中應(yīng)用頗為廣泛。Zheng等［12］研究發(fā)現(xiàn)，TPL 可以保護足細胞減輕嘌呤霉素導(dǎo)致的細胞骨架損傷以及Nephrin 和Podocin 的異常表達，作用機制主要與影響p38 MAPK 信號通路、參與抑制ROS 的產(chǎn)生以及RhoA 活性恢復(fù)等有關(guān)。在被動性Heymann 腎炎（PHN）膜性腎病大鼠模型中，TPL 可以明顯減少蛋白尿，減輕免疫介導(dǎo)的腎臟損傷［13］。體外膜攻擊復(fù)合物C5b-9 誘導(dǎo)的足細胞損傷模型中，TPL 可以減輕C5b-9 介導(dǎo)的足細胞損傷，其中可能涉及與MAPK 相關(guān)的多條信號通路。上述圍繞TPL 的實驗研究主要涉及嘌呤霉素、阿霉素以及C5b-9 誘導(dǎo)的損傷模型。本研究以LPS誘導(dǎo)的足細胞損傷模型為研究對象，探究TPL 對足細胞細胞骨架的保護作用，結(jié)果提示TPL 對足細胞骨架有一定的保護作用，可通過調(diào)節(jié)重要蛋白質(zhì)分子的表達，在一定程度上緩解LPS 造成的足細胞損傷。臨床上應(yīng)用較多的雷公藤多苷是從植物雷公藤中提取的含多種成分的混合物，減輕了部分雷公藤的毒性作用，其主要不良反應(yīng)包括肝腎功能損害和消化系統(tǒng)癥狀等。本研究中所用TPL 試劑是從中藥雷公藤中提取的高純度的單一物質(zhì)。文獻表明TPL 有一定的細胞毒性［39］，目前臨床中尚無應(yīng)用，其毒副作用研究尚需進一步實驗。

足細胞損傷是多數(shù)腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機制，探究如何保護足細胞功能結(jié)構(gòu)的完整已成為研究治療腎臟疾病藥物的重要方向之一。足細胞正常細胞骨架的維持、足細胞骨架異常重排過程涉及眾多分子間的相互作用及多條信號通路調(diào)控［40］。我們的研究初步提示，TPL 對LPS 造成的足細胞損傷有較好的保護作用，可能與其提高CD2AP、Synatopodin、Palladin、Vinculin 表達以及降低Angptl3 表達有一定的關(guān)系，但具體機制有待進一步探究，特別是明確相關(guān)分子之間的相互關(guān)系，將有助于更好地探討足細胞的保護作用。