周 玲,范潤哥,李東明,劉 恒,舒 偉,3?

(1.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,南寧 530021; 2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科,南寧 530021;3.桂林醫(yī)學院生物技術學院,廣西 桂林 541100)

核纖層( nuclear lamina ) 是由核纖層蛋白(lamins)組成的網(wǎng)狀結構,位于細胞核膜內側,核纖層蛋白是進化上高度保守的Ⅴ型中間纖維蛋白(intermediate filament protein, IF protein),在維持細胞核的正常結構與功能、染色質定位和基因轉錄、以及細胞衰老與分化等細胞進程中發(fā)揮著重要作用[1]。 在哺乳動物中,lamins 分為A 型和B 型,A型lamins 包括lamin A、lamin C 以及含量較低的亞型A△10、lamin C2,由LMNA基因選擇性剪切產生。B 型lamins 包 括lamin B1、 lamin B2, 由LMNB1、LMNB2 基因編碼產生。 A 型lamins 一般只在原胚胎形成后分化的細胞中表達,而B 型lamins 表達貫穿整個發(fā)育過程[2-3]。

由于細胞內許多不同蛋白質直接或間接與lamins 相互作用,LMNA、LMNB1 和LMNB2 基因發(fā)生突變常常造成多種效應。LMNA基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)963 個(www.ncbi.nlm.nih.gov / clinvar/)突變,這些突變與至少15 種被稱為 “ 核纖層蛋白病” 的疾病相關,包括常染色體遺傳病埃- 德型肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD)、 擴張型心肌病( Dilated cardiomyopathy, DCM)、 早老癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HGPS)、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥( Limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)等。 以HGPS 為例,由于LMNA基因發(fā)生點突變引起外顯子11 隱蔽剪切位點(G608G:GGC→GGT)激活,導致核纖層蛋白A 前體(prelamin A)肽鏈羧基末端50 個氨基酸殘基被切除,這個被截短的prelamin A 被稱為早老蛋白(progerin)。 progerin 保留了CXXA 結構域,而缺失ZMPSTE 24 酶切位點,導致羧基末端不能被剪切,暴露在外的法尼基半胱氨酸甲酯一直存在。 隨著時間的推移,progerin 蓄積會導致一系列細胞缺陷和功能障礙,最終造成細胞和組織器官的衰老[4]。 為了研究由于LMNA基因突變造成的疾病并探尋其中的具體機制,人們構建了多種核纖層蛋白病小鼠模型,本文將對核纖層蛋白病小鼠模型進行綜述。

1 LMNA 基因缺失突變小鼠模型

1.1 Lmna-/ -和LmnaGT-/ -小鼠模型

第一個LMNA基因突變小鼠模型是lamin A/ C缺失(Lmna-/-小鼠模型)。Lmna-/-小鼠白色脂肪儲存減少、生長遲緩、心律失常和核膜蛋白emerin 分布異常,出生后6 ～8 周齡死亡,Lmna+/-小鼠在4 ～6周齡時顯示出中度嚴重性的心臟功能障礙和心肌細胞損傷。 有趣的是,研究表明Lmna+/-小鼠在12個月齡時表現(xiàn)出嚴重的心臟異常,與LMNA基因突變引起的DCM 表型相似[5-6]。 Kubben 等[7]通過基因捕獲技術構建了一種新的lamin A/ C 缺失小鼠模型(LmnaGT-/-小鼠模型)。LmnaGT-/-小鼠在出生后2～3 周齡死亡。 在Lmna-/-小鼠等模型以及EDMD患者肌肉活檢中發(fā)現(xiàn),核膜和DNA 損傷是由骨骼肌成熟過程中的核遷移引起的,并與疾病的嚴重程度相關。 這些發(fā)現(xiàn)暗示機械誘導的DNA 損傷是LMNA基因突變引起骨骼肌疾病的致病因素之一[8]。 研 究 發(fā) 現(xiàn) mTORC1 ( mammalian target of rapamycin complex 1, mTORC1)在Lmna-/-小鼠的心肌和骨骼肌組織中上調,用mTOR 抑制劑治療突變小鼠,能夠逆轉mTORC1 信號升高,從而引起自噬激活促進progerin 溶解和清除,減輕細胞衰老,挽救心臟和骨骼肌功能,并延長壽命[9]。

1.2 LAO、PLAO 和LCO 小鼠模型

為了證明prelamin A 加工過程的重要性,Coffiner 等[10]構建僅合成lamin A 的轉基因小鼠模型(LAO 小鼠模型) 和僅合成prelamin A 的轉基因小鼠模型(PLAO 小鼠模型)。 在LmnaLAO/LAO小鼠中l(wèi)amin A 是直接合成的,而在LmnaPLAO/PLAO小鼠中l(wèi)amin A 是 通 過 prelamin A 加 工 合 成。 盡 管LmnaLAO/LAO小鼠沒有了prelamin A 的加工步驟,但兩個突變小鼠模型中成熟lamin A 的水平是相當?shù)?。LmnaLAO/LAO小鼠正常、健康,沒有任何明顯的病理表型,存活時間(>24 個月)與野生型(Wild Type,WT)小鼠相當,然而LmnaLAO/LAO和LmnaPLAO/PLAO小鼠成纖維細胞比Lmna+/+小鼠成纖維細胞有更高的核畸形率,這表明細胞異常與組織病理的嚴重程度并不一致。 有趣的是,只合成lamin C(LCO 小鼠模型)不合成lamin A 的小鼠也表現(xiàn)為完全健康[11]。這些研究結果表明小鼠中prelamin A 加工是可有可無的,lamin A 和lamin C 功能存在互補,缺乏其中之一并不會引起病理表型,但是同時缺乏lamin A 和lamin C 卻是致命的。

2 LMNA 基因錯義突變小鼠模型

2.1 Lmna N195 K 和Lmna H222P 小鼠模型

兩個攜帶LMNA基因錯義突變的小鼠模型再現(xiàn)了人類疾病的表型:一個是LMNA基因第195 位的天冬酰胺突變?yōu)橘嚢彼?N195 K 小鼠模型),導致家族性擴張型心肌病伴傳導系統(tǒng)疾病( familial dilated cardiomyopathy with conduction systems disease, DCM-CD1)[12]。 另一個是LMNA基因第222 位的組氨酸突變?yōu)楦彼?H222P 小鼠模型),導致常染色體顯性遺傳EDMD (autosomal dominant inheritance, AD-EDMD)[13]。 有趣的是,雖然雜合子小鼠沒有發(fā)現(xiàn)異常,但LmnaN195K/N195K小鼠出現(xiàn)嚴重心律失常而過早死亡[12]。 與WT 小鼠相比,LmnaN195K/N195K小鼠的心室肌細胞動作電位持續(xù)時間 更 長, 晚 期 鈉 電 流( Na+) 增 加[14]。 同 樣LmnaH222P/H222P小鼠表現(xiàn)出骨骼肌和心肌的營養(yǎng)不良,純合子小鼠在13 月齡全部死亡[13]。 研究發(fā)現(xiàn)LmnaH222P/H222P小鼠心肌中MAPK、JNK、p38α、ERK1 /2、AKT/ mTORC1、TGF-β 信號上調,WNT/ β-catenin信號下調,連接蛋白43(connexin 43, CX43)低表達并且分布改變,微管細胞骨架不穩(wěn)定導致CX43 重塑, 其 中ERK1 / 2、 AKT/ mTORC1、 TGF-β、 WNT/ βcatenin 信號已經(jīng)證實與DCM 的發(fā)病機制有關,藥物阻斷這些信號通路以及改變CX43 定位可以改善LmnaH222P/H222P小鼠的左心室功能[15-16]。 研究者正在進一步探索通過聯(lián)合用藥阻斷以上信號通路對LMNA基因突變引起的DCM 的治療效果。

2.2 LmnaM371 K 小鼠模型

人類患EDMD 主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳病,為了確定LMNA基因突變是否能以顯性方式引起小鼠EDMD 樣表型。 Wang 等[17]構建了M371 K轉基因小鼠模型( 第371 位甲硫氨酸突變?yōu)橘嚢彼?導致AD-EDMD)。 雜合子小鼠的出生率明顯低于預期,可能是由于突變蛋白影響小鼠早期胚胎發(fā)育。 小鼠出生后存活2 ～7 周,表現(xiàn)為心肌細胞胞質嗜酸性粒細胞增多、肌原纖維碎裂、核破裂、核固縮和細胞水腫,病灶多發(fā),無纖維化或明顯炎癥,提示急性或亞急性心臟損傷。 然而,人類患EDMD 更具有漸進性和擴張性,心臟受累是最嚴重的并發(fā)癥,表現(xiàn)為房室傳導異常,左心室擴張和室性心律失常,左室為主的心肌細胞破壞隨著疾病的進展而加重。 因此,該小鼠模型并沒有完全模擬人類患EDMD 的表型,這種差異產生的原因可能是由于M371 K 突變蛋白在該小鼠模型高表達。

2.3 LmnaL530P 小鼠模型

研究者在一例常染色體顯性EDMD 患者中發(fā)現(xiàn)一個LMNA基因L530P 變異(第530 位亮氨酸突變?yōu)楦彼?,Monkes 等[18]構建了L530P 小鼠模型。 6 個月齡的雜合子小鼠與WT 小鼠表型相似。純合子小鼠在4-6 日齡時開始呈現(xiàn)早老表型,并在4～5 周內死亡,純合子小鼠步態(tài)蹣跚、皮下脂肪層缺乏、毛囊密度降低、心肌和骨骼肌輕度至中度變性、發(fā)育不良和萎縮。 此外,研究者還發(fā)現(xiàn)小鼠成纖維細胞細胞核形態(tài)異常,lamin A 表達減少,lamin C 細胞核內定位錯誤。

2.4 LmnaE82 K 小鼠模型

在一個擁有50 個家族成員的中國人DCM 家系中發(fā)現(xiàn)LMNA基因的一個新突變E82 K,正是這種突變導致了DCM 的發(fā)生。 呂丹等[19]構建了E82 K轉基因小鼠模型。 該轉基因小鼠表現(xiàn)為心腔擴張、心臟重量增加、心肌纖維化增加,B 型鈉尿肽、血清Ⅲ型前膠原和骨骼肌肌動蛋白α1 水平升高、核膜斷裂和傳導受損,這與攜帶E82 K 突變患者的表型相似。 有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)E82 K 轉基因小鼠的細胞凋亡水平是WT 小鼠的8.5 倍,Fas 和線粒體凋亡通路均被激活,這可能與左心室功能下降和最終心力衰竭有關。LMNA基因的E82 K 突變或Lamin A/C 桿狀區(qū)突變都可能是導致心肌細胞凋亡和心室功能障礙的重要原因。 這可能是抑制LMNA突變患者心肌細胞死亡的一種潛在的治療靶點。

3 LMNA 基因早老突變小鼠模型

3.1 LmnaHG小鼠模型

HGPS 是最嚴重的核纖層蛋白病之一。 為了研究該病的致病機制,Yang 等[20]構建了LmnaHG小鼠模型,該小鼠只產生progerin。 純合子和雜合子小鼠都表現(xiàn)出與HGPS 患者相似的表現(xiàn),包括皮下脂肪減少、脫發(fā)、骨質疏松癥和過早死亡。 然而,該小鼠模型沒有發(fā)現(xiàn)類似人類患者的心血管問題[20-22]。

3.2 攜帶LMNAG608G-BAC 致病基因的小鼠模型

第二個關于HGPS 的小鼠模型是通過產生帶有細菌人工染色體(BAC) 的轉基因來構建早老小鼠模型,BAC 攜帶LMNAG608G 突變( G608G BAC 小鼠模型)。 與LmnaHG小鼠模型不同,該轉基因小鼠沒有HGPS 外部表型,但血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) 漸進性丟失,在一些HGPS 患者的尸檢中也觀察到這一特征。 目前還不清楚為什么這個模型的表型局限于VSMCs[22]。

3.3 金屬蛋白酶ZMPSTE24 缺失型小鼠模型

ZMPSTE24 是一種在小鼠和人體內處理法尼基化prelamin A 的金屬蛋白酶。 人體缺乏ZMPSTE24會導致限制性皮膚病(Restrictive dermopathy, RD)的發(fā)生,從而造成圍產期死亡[23]。 Bergo 和Pendas等[24-25] 建立了2 種ZMPSTE24 缺失小鼠模型(Zmpste24-/-小鼠模型),這2 種小鼠模型都沒有產生成熟的lamin A,反而因為缺失Zmpste24 而導致法尼基化prelamin A 蓄積。 在Bergo 等[24]構建的小鼠模型中,純合子小鼠出生時表現(xiàn)是正常的,后來出現(xiàn)異常,包括生長遲緩、脫發(fā)、肌無力、最顯著的是多發(fā)性骨折。 在Pendás 等[25]構建的小鼠模型中,純合子小鼠表現(xiàn)出生長遲緩、DCM、肌營養(yǎng)不良、脂肪營養(yǎng)不良和過早死亡。 這2 個小鼠模型的表型都與HGPS 患者的表型相似,提示prelamin A法尼基化至少部分的影響了HGPS 的表型。 研究表明,法尼基化抑制劑( farnesyltransferase ( FTase)inhibitors, FTIs) 可以抑制progerin 蓄積或prelamin A 法尼基化,聯(lián)合他汀類藥物使用可以增加HGPS患者骨密度從而改善早老表型[26-27]。

3.4 LmnaG609G小鼠模型

早老小鼠模型中較為受到關注的是Osorio 等[28]構建的LmnaG609G小鼠模型,LmnaG609G/G609G小鼠在出生至出生后3 周生長速度減慢,體重進行性下降,不孕,姿勢異常,脊柱后凸,平均100 日齡時過早死亡。 雜合子小鼠雖也出現(xiàn)過早死亡,但死亡率較低,大多數(shù)在出生后8 個月前都是正常表型,平均生存時間為242 d。 雜合子小鼠出現(xiàn)血管硬化,與載脂蛋白E 敲除(Apoe-/-)小鼠雜交出現(xiàn)動脈粥樣硬化,主動脈鈣化嚴重以及抑制血管鈣化的能力受損[29]。 由于LmnaG609G小鼠模型出現(xiàn)了HGPS 患者中觀察到的大多數(shù)變化,該小鼠模型已經(jīng)成為尋找HGPS 患者治療措施的首選模型。 研究者利用了反義寡核苷酸、藥物、飲食以及激活體內的重新編程等來治療LmnaG609G小鼠[30-31],最近,研究者利用CRISPR-Cas9 技術靶向干擾lamin A/ Progerin 來治療HGPS, 治療后的LmnaG609G小鼠抑制了表皮變薄和真皮脂肪丟失、改善了姿勢、體重以及主動脈弓VSMCs 的退化。 小鼠看起來更活躍、健康、以及生存期延長[32]。

3.5 其他早老突變小鼠模型

Yang 等[33]考慮到非法尼基化progerin 有誘發(fā)疾病的可能性,因此構建了表達非法尼基化progerin小鼠模型(LmnanHG小鼠模型)。LmnanHG小鼠與LmnaHG小鼠表型相似但癥狀輕一些。LmnanHG小鼠胚胎成纖維細胞( mouse embryonic fibroblasts,MEFs)畸形細胞核百分率比LmnaHG小鼠低。 FTIs對LmnanHG小鼠MEFs 沒有療效。 這些結果表明,非法尼基化progerin 仍然是有毒性的,用FTIs 阻斷法尼基化并不能完全逆轉HGPS 患者的progerin 誘導的表型。 為了避免progerin 在早期發(fā)育過程中潛在毒性,以及progerin 對表皮角質形成細胞的影響,Mckenna 等[34]構建了一個在Tet 操縱子控制下表達lamin A 和progerin 的誘導系統(tǒng)。 分別表達野生型lamin A(tetop-LAwt 小鼠模型)和HGPS G608G 突變體(tetop-LAG608G小鼠模型)。 通過將tetop-LAwt 和tetop-LAG608G轉基因小鼠與表達K5tTA 轉基因小鼠雜交,突變基因的表達定向到毛囊間表皮和毛囊的基底細胞。 這些表達progerin 的雙轉基因小鼠中,最終表現(xiàn)出皮下脂肪丟失、纖維化和皮脂腺發(fā)育不完全。 其他值得注意的異常包括牙齒問題、脫發(fā)、生長遲緩和過早死亡。 由于HGPS 患者的皮膚受到嚴重影響,Wang 等[35]構建了利用角蛋白14 啟動子(Keratin 14 promoter,K14 promoter)在表皮組織中表達progerin 的轉基因小鼠模型(K14-progerin 小鼠模型),K14-progerin 小鼠分離的原代角質形成細胞雖然具有異常的核形態(tài),但仍有正常的毛發(fā)和傷口愈合能力。 這些觀察結果表明細胞異常與組織病理的嚴重程度并不一致。 正如Varga 等[22]提出的一樣,某些組織如橫紋肌,細胞不斷受到機械壓力,可能對核結構異常更敏感,而其他組織如表皮,盡管核形狀發(fā)生了改變,也能夠繼續(xù)發(fā)揮生理功能。 最近研究發(fā)現(xiàn),LMNA基因R527C 純合突變會導致兒童早老癥,但LMNAR527C 基因突變導致的早老癥患者細胞內并沒有 prelamin A 和 progerin 蓄 積[36]。 目 前,LMNAR527C 基因突變導致的早老癥致病機制尚不清楚。 李東明等[37]構建了一個R527C 小鼠模型,觀察LmnaR527C/R527C小鼠的表型,發(fā)現(xiàn)LmnaR527C/R527C小鼠未出現(xiàn)相關臨床疾病的表型,但是小鼠皮膚組織γH2Ax蛋白水平升高,成纖維細胞衰老數(shù)量百分比增加,DNA 損傷增加,基因組不穩(wěn)定,衰老加速。 這些結果表明細胞異常與組織病理的嚴重程度并不一致。

4 結語與展望

核纖層蛋白病類型復雜多樣,引起人們的廣泛關注,為了深入研究其分子機制,開發(fā)針對相應疾病的孤兒藥,人們構建了多種種屬的動物模型,比如斑馬魚[38]、尤加坦小型豬[39]、兔[40]等,而小鼠模型的構建尤為眾多,本文概述了文獻報道的主要核纖層蛋白病小鼠模型(見表1、表2、表3)。 考慮到物種間高度保守的基因組維持機制,核纖層蛋白病小鼠模型可以作為一個有價值的模型來研究個體和細胞衰老過程中代謝途徑的改變和可能的治療策略,以進一步提升我們對正常生理性衰老過程的認識,也有助于了解與衰老相關的慢性和退行性疾病(阿爾茨海默病、帕金森病、動脈粥樣硬化、糖尿病和癌癥等)的病理特征。

表1 LMNA 基因/ 片段缺失突變小鼠模型Table 1 Mouse models with LMNA gene or fragment deletion mutation

表2 LMNA 基因錯義突變小鼠模型Table 2 Mouse models with LMNA gene missense mutation

表3 LMNA 基因早老突變小鼠模型Table 3 Mouse models with LMNA gene progeroid mutation