史文倩 黃花榮

【關(guān)鍵詞】 Toll 樣受體4;信號傳導(dǎo)通路;哮喘

支氣管哮喘是常見的、反復(fù)發(fā)作的氣道免疫炎癥性疾病，往往由多種因素所誘發(fā)，表現(xiàn)為氣道的高反應(yīng)性、發(fā)作性氣道阻塞、肺功能減退等[1]。哮喘是由復(fù)雜的基因-免疫-環(huán)境等因素相互作用引起的[2]。Toll樣受體（TLR）在炎癥性和免疫性疾病中扮演著重要的角色，TLR通過固有免疫病原模式識別多種免疫細胞，啟動非特異性免疫應(yīng)答以消除病原體[3]。其中TLR4與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。有研究表明，TLR能夠引起炎癥因子釋放，抑制TLR4信號通路可有效降低TLR4相關(guān)炎性細胞因子的表達，這為哮喘的治療提供了新的思路[5]。本文就TLR4信號傳導(dǎo)通路的作用機制、TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與哮喘發(fā)病機制、靶向TLR4治療哮喘的研究進展進行綜述。

一、TLR4結(jié)構(gòu)與功能

TLR屬于模式識別受體（PRR），能夠直接識別外來病原體及其產(chǎn)物或宿主畸變和衰老凋亡細胞某些共有特定模式分子結(jié)構(gòu)。目前，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了14種TLR，其中10種亞型在人類中表達，根據(jù)其分布部位可以分為胞膜型PRR和內(nèi)體膜型PRR[6]。胞膜型PRR包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，它們分布在細胞膜表面，主要識別脂質(zhì)和蛋白質(zhì);內(nèi)體膜型PRR包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，它們分布在細胞器膜上，主要識別核酸。

1997年發(fā)現(xiàn)的TLR4是首個與髓樣分化因子2（MD-2）、CD14、脂質(zhì)結(jié)合蛋白（LBP）和放射性保護性105kDa蛋白（RP105）等多種共同受體同時存在的TLR成員[7]。TLR4為Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)和跨膜區(qū)3部分組成。TLR4的N端，即胞外區(qū)包含大約16～28個亮氨酸富集重復(fù)序列（LRR），主要用來識別外源性病原體相關(guān)模式分子（PAMP）和內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（DAMP）。TLR4的C端，即胞內(nèi)區(qū)包含一個結(jié)構(gòu)相對保守的Toll/IL-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域，負責起始胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，引發(fā)下游適配器蛋白的招募[8-9]。

二、TLR4信號傳導(dǎo)通路與生物學(xué)作用

TLR4信號傳導(dǎo)分為MyD88依賴和MyD88獨立（TRIF依賴）通路。MyD88依賴通路負責促炎細胞因子的表達，而MyD88獨立通路介導(dǎo)Ⅰ型IFN和IFN誘導(dǎo)基因的誘導(dǎo)[10]。

1. MyD88依賴通路

革蘭陰性菌細胞壁外膜的脂多糖（LPS）是TLR4的特異性配體[11]。單純轉(zhuǎn)染TLR4不足以識別LPS，并且配體誘導(dǎo)的活化需要TLR4與細胞表面MD-2相結(jié)合[12]。MD-2與LPS相互作用，然后與TLR4的細胞外結(jié)構(gòu)域非共價結(jié)合，形成TLR4/MD-2受體復(fù)合物[13]。LBP和CD14是增強LPS傳感的輔助分子，LBP能夠從聚集體中提取LPS單體并將其轉(zhuǎn)移到CD14中，CD14受體通過膜結(jié)合形式結(jié)合單體LPS并將其轉(zhuǎn)移到MD-2，促進六聚物復(fù)合物（TLR4/MD-2/LPS）2的形成，從而誘導(dǎo)含有TIR結(jié)構(gòu)域的適配器蛋白的募集[14]。這些適配器通過TLR4細胞質(zhì)尾部的TIR結(jié)構(gòu)域與適配器上的TIR結(jié)構(gòu)域之間的同質(zhì)相互作用與TLR4簇相關(guān)聯(lián)。

在LPS刺激下，MyD88依次募集并激活I(lǐng)L-1R受體相關(guān)激酶4（IRAK-4）、IRAK-1、TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）[15]。IRAK-4不僅負責招募、激活I(lǐng)RAK-1，還負責降解IRAK-1，IRAK-2也在LPS/TLR4信號傳遞中起作用[16-17]。TRAF6與泛素結(jié)合酶13（UBC13）、泛素結(jié)合酶E2變異體1異構(gòu)體A（UEV1A）形成復(fù)合物，激活轉(zhuǎn)化生長因子-β活化的蛋白激酶1（TAK1），然后TAK1激活下游IκB激酶（IKK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。IKKα、IKKβ、IKKγ形成復(fù)合物催化IκB蛋白磷酸化，這種磷酸化導(dǎo)致IκB蛋白的降解和隨后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的易位，進而引起IL-6、IL-12p40、TNF-α等多種炎癥因子的表達[18]。下游MAPK途徑的激活導(dǎo)致另一種轉(zhuǎn)錄因子AP-1的誘導(dǎo)，該因子在促炎細胞因子的表達中同樣發(fā)揮了作用[19]。此外，IκBε和IFN調(diào)節(jié)因子5（IRF5）也是MyD88通路下游的2個重要因子。在LPS刺激下，缺乏IκBε的巨噬細胞對IL-6的表達有缺陷，而對TNF-α的表達正常。在IL-6的啟動子區(qū)，IκBε可能與NF-κBp50亞基一起發(fā)揮作用[20]。以上就是TLR4的MyD88依賴通路，見圖1。

2. MyD88獨立（TRIF依賴）通路

該通路的激活發(fā)生在TLR4-MD2復(fù)合物內(nèi)化后的內(nèi)小體室。其激活涉及到TRIF相關(guān)適配器分子（TRAM）和含TIR結(jié)構(gòu)域適配器誘導(dǎo)IFN-β（TRIF）的募集，TNF受體相關(guān)因子3（TRAF3）的激活，以及由TANK結(jié)合激酶1（TBK）和IKKε介導(dǎo)的IFN調(diào)節(jié)因子3（IRF3）核易位的誘導(dǎo)[21-22]。其中IRF3轉(zhuǎn)錄因子能夠促進Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，見圖1。

3. TLR4信號傳導(dǎo)通路觸發(fā)因素

3.TLR4信號傳導(dǎo)通路觸發(fā)因素除了識別外源性微生物PAMP外，TLR4還能識別內(nèi)源性DAMP，TLR4的細胞內(nèi)觸發(fā)因素包括高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和細胞熱休克蛋白等，其中HMGB1與哮喘密切相關(guān)[23]。HMGB1是一種非組蛋白且普遍存在的染色體蛋白，在活性染色質(zhì)中富集，是HMGB家族的一部分，由人的HMGB1基因（13q12）編碼[24]。HMGB1可與TLR4結(jié)合激活NF-κB引起下游的炎癥介質(zhì)釋放，有研究表明，阻斷HMGB1活性能通過抑制氣道炎癥和調(diào)節(jié)肺成纖維細胞表型和激活來逆轉(zhuǎn)氣道重塑[25]。

4.TLR4參與載脂蛋白E（APOE）信號通路

APOE的主要功能是促進受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和脂蛋白顆粒（例如極低密度脂蛋白和乳糜微粒）及膽固醇向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，此外APOE還具有促炎和抗炎作用，這取決于APOE的濃度。在鼠螨引起的哮喘小鼠模型中，APOE基因敲除小鼠表現(xiàn)出增強的氣道反應(yīng)性和杯狀細胞增生[26]。與健康受試者及COPD患者相比，哮喘患者血漿中的APOE降低，IL-33升高[27]。研究證明高水平的APOE信號通過TLR4激活TAK1和IκKβ，IκKβ磷酸化NF-κBp65和TPL2，進而磷酸化c-Jun氨基末端激酶（JNK），從而誘導(dǎo)人哮喘小氣道上皮細胞（SAEC）分泌C-X-C基序趨化因子配體5（CXCL5）促進氣道炎癥[28]。

三、TLR4信號傳導(dǎo)通路與哮喘發(fā)病機制

1. TLR4與“衛(wèi)生假說”

Strachan提出了“衛(wèi)生假說”，該假說提出兒童期減少接觸傳染性微生物會導(dǎo)致后期過敏性疾病風(fēng)險增加。病原微生物能夠促進免疫系統(tǒng)早期成熟，通過刺激1型輔助性T淋巴細胞（Th1）成熟，抑制Th2極化，最終降低IgE水平。相反，免疫成熟過程中的“干凈”環(huán)境可能導(dǎo)致Th2持續(xù)存在。接觸內(nèi)毒素可能為“衛(wèi)生假說”提供一種統(tǒng)一的機制。有研究表明，房屋灰塵和床墊灰塵中較高的內(nèi)毒素水平與變態(tài)反應(yīng)致敏和特應(yīng)性哮喘的風(fēng)險較低有關(guān)[29]。PRR識別內(nèi)毒素，并通過由LPS、CD14、MD-2和TLR4形成的內(nèi)毒素受體復(fù)合物激活先天免疫系統(tǒng)。這說明TLR4與“衛(wèi)生假說”密切相關(guān)。

2. HMGB1與哮喘密切相關(guān)

2.HMGB1與哮喘密切相關(guān)HMGB1是一種高度保守的核蛋白，既可以由單核細胞、巨噬細胞和其他免疫細胞主動釋放到細胞外，也可從受損的壞死組織細胞中被動釋放，以促進多種炎癥因子分泌[30]。此外，HMGB1還具有細胞外活性，即HMGB1能在內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式中起作用，通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和TLR相互作用，調(diào)節(jié)參與磷酸化和糖基化終產(chǎn)物合成的受體，這些受體導(dǎo)致某些細胞因子如TNF-α、IL-4和IL-6的增加[31]。研究表明HMGB1與RAGE、TLR2和TLR4的相互作用會激活MAPK和NF-κB的細胞內(nèi)信號，引起促炎性細胞因子的激活和釋放[32]。

3. TLR4基因多態(tài)性與哮喘發(fā)生的風(fēng)險

大量研究表明TLR2、TLR4和TLR9與哮喘或特應(yīng)性疾病的發(fā)病機制有關(guān)[33]。TLR4多態(tài)性可以改變兒童的先天免疫反應(yīng)，并可能是哮喘發(fā)展的重要決定因素。CD14通過促進LPS向TLR4的表達促進免疫激活，這會觸發(fā)IL-12和IL-18的信號傳導(dǎo)以及IFN產(chǎn)生。研究表明該反應(yīng)受遺傳控制，由Asp299Gly（核苷酸取代896A>G）組成的TLR4基因（染色體9q32-33）中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與吸入內(nèi)毒素攻擊的反應(yīng)性低下，氣道上皮中TLR4的密度降低以及炎癥細胞因子對內(nèi)毒素的反應(yīng)減少有關(guān)[34]。這種多態(tài)性改變了受體對內(nèi)毒素的反應(yīng)，這是哮喘的重要誘因。

北美的研究者檢測了TLR4在哮喘中的多態(tài)性，在研究中對TLR4基因進行了篩選，共發(fā)現(xiàn)了29個SNP[35]。TLR4Asp299Gly等位基因與較高的革蘭陰性菌感染發(fā)生率有關(guān)，這可能有助于特應(yīng)性兒童哮喘的發(fā)展[36]。TLR4Asp299Gly多態(tài)性還與兒童外周血單核細胞（PBMC）降低LPS誘導(dǎo)的IL-12（p70）和IL-10反應(yīng)有關(guān)[37]。在攜帶TLR4Asp299Gly等位基因的人群中，特應(yīng)性疾病的嚴重性升高，這表明TLR4Asp299Gly多態(tài)性導(dǎo)致先天免疫系統(tǒng)的反應(yīng)降低，由此可見TLR4基因多態(tài)性與哮喘患者的特應(yīng)性嚴重程度呈正相關(guān)[38]。除此之外，TLR2中的rs3804099和TLR4中的rs4986791也會導(dǎo)致罹患哮喘的風(fēng)險增加[39]。

4.靶向TLR4及其信號通路治療哮喘的價值

目前哮喘治療的目的是盡量減少藥物不良反應(yīng)，并實現(xiàn)良好的哮喘控制，然而對于重癥哮喘患者，目前還沒有最佳治療方法。免疫性疾病的抗免疫治療已由廣泛的抗炎治療轉(zhuǎn)為靶點治療，TLR4及其信號通路為哮喘的治療提供了多個新的潛在治療靶點，如TLR4拮抗劑、抗LPS多肽、抗HMGB1抗體等。

將TLR4拮抗劑TAK-242注入卵清白蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠腹腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)，TAK-242能夠降低小鼠鼻灌洗液中Th2細胞因子的水平，減少支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞和肺中Th2的數(shù)量[40]。沙格列汀是一種二肽基肽酶4抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)沙格列汀可以通過抑制TLR4/活性氧簇/NF-κB信號通路有效減輕OVA誘發(fā)哮喘小鼠的氣道炎癥，降低小鼠肺組織中的氧化應(yīng)激以及NF-κB和TLR4的水平，這表明沙格列汀可能成為有效治療急性過敏性哮喘的潛在藥物[41]。白藜蘆醇是存在于葡萄皮、漿果和堅果中的一種植物多酚物質(zhì)[42]。白藜蘆醇的有益作用已在肺纖維化、COPD、肺動脈高壓和其他肺部疾病中得到證實[43-44]。有研究表明，大劑量的白藜蘆醇通過抑制HMGB1/TLR4/NFκB途徑釋放的炎性細胞因子，減輕哮喘誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道重塑，這為白藜蘆醇作為潛在的新型哮喘治療方法提供了證據(jù)[45]。丹皮酚降低了小鼠TLR4的表達和NFκB的核易位，以及哮喘模型中p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平，通過抑制TLR4/NFκB和MAPK信號通路改善OVA誘導(dǎo)的哮喘[46]。抗HMGB1抗體能夠減少鄰苯二甲酸二異壬酯誘導(dǎo)的哮喘小鼠的Th2細胞因子、炎性細胞積累、黏蛋白產(chǎn)生，減輕氣道高反應(yīng)性及肺組織損傷[47]。

四、結(jié)語

TLR4信號傳導(dǎo)通路作為機體免疫功能的一部分，與炎癥性和免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。TLR4信號傳導(dǎo)通路存在多個治療哮喘的潛在靶點，針對TLR4信號傳導(dǎo)通路靶點的靶向治療，為哮喘的治療提供了一個新的研究方向，有著良好的研究前景。CC趨化因子受體5（CCR5）能夠調(diào)控T細胞和單核細胞/巨噬細胞系的遷移、增殖與免疫功能，但其與TLR4信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系未見相關(guān)報道[48]。筆者課題組先前發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠體內(nèi)應(yīng)用CCR5第二胞外環(huán)的拮抗短肽能有效減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥程度，抑制TNF-α的表達[49]。TLR4信號傳導(dǎo)通路的激活能引起TNF-α、IL-4和IL-6等炎性細胞因子的釋放，CCR5拮抗劑是否能夠調(diào)控TLR4信號傳導(dǎo)通路緩解哮喘炎癥反應(yīng)值得進一步探究。