邰秋園，屈曉君，趙艷豐，柏婷婷，郭志睿，朱葉飛

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，南京210011；2.南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南京 211200)

拉曼光譜技術(shù)是一種光散射技術(shù)，因其具有快速、實時、無損傷、易于操作、受水分干擾小等優(yōu)勢，在臨床微生物檢測領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力[1]。表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced raman spectroscopy, SERS)利用拉曼光譜技術(shù)與納米技術(shù)結(jié)合，能增強(qiáng)其光譜強(qiáng)度達(dá)103～106倍[2]，克服了拉曼光譜信號微弱的不足[3]。上世紀(jì)末，Efrima等[4]首次描述了大腸埃希菌的SERS光譜，開啟了利用SERS技術(shù)進(jìn)行微生物檢測的探索。

為提高從復(fù)雜環(huán)境中檢出細(xì)菌的能力，很多學(xué)者采用拉曼光譜報告分子和抗體、噬菌體等識別分子修飾金屬納米結(jié)構(gòu)表面，但這些識別分子的成本高，穩(wěn)定性較差，制備方法困難[5]。萬古霉素作為糖肽類抗菌藥物，其羧基與細(xì)菌細(xì)胞壁成分胞壁酰五肽末端D-Ala-D-Ala形成氫鍵復(fù)合物，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成。因其具有穩(wěn)定性好、成本低、質(zhì)量可控等優(yōu)點，萬古霉素修飾的SERS底物可用于細(xì)菌捕獲和檢測[6]。

有學(xué)者利用萬古霉素修飾介孔二氧化硅納米顆粒選擇性識別革蘭陽性細(xì)菌[7]或者萬古霉素修飾銀磁性納米顆?？焖贆z測金黃色葡萄球菌的SERS光譜[6]，而本研究利用萬古霉素捕獲細(xì)菌的特性，制作萬古霉素修飾玻片基底，用于金黃色葡萄球菌的捕獲及其SERS光譜的檢測，以期在不需要進(jìn)行體外細(xì)菌培養(yǎng)下，建立快速檢測金黃色葡萄球菌的方法。

1 材料與方法

1.1材料 顯微鏡蓋玻片(規(guī)格18 mm×18 mm×0.16 mm，世態(tài)公司)，氫氧化鈉、無水乙醇(國藥集團(tuán))，3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltrimethoxysilane，APTES，賽默飛世爾公司)，萬古霉素、碳二亞胺[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochoride purum，EDC，Sigma-Aldrich公司]，2-(N-嗎啉)乙磺酸[2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid，MES，Alfa Aesar公司]，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(trypticase soy broth，TSB，海博生物公司)，Milli-Q Reference超純水(Merck Millipore公司)，直徑約40 nm的膠體銀懸浮顆粒[8](自制)。

1.2儀器 inVia激光顯微拉曼光譜儀(Renishaw公司)，NICOLET 5700傅里葉紅外光譜儀(Thermo公司),UV3600紫外可見分光光度計(Shimadzu公司)，Ultra Plus掃描電子顯微鏡(Zeiss公司)，Vitek 2細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。

1.3菌株 金黃色葡萄球菌臨床分離菌株經(jīng)Vitek 2細(xì)菌鑒定儀鑒定為金黃色葡萄球菌。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng) 金黃色葡萄球菌在37 ℃、TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，取1 mL，用滅菌的PBS離心洗滌3次，最后用生理鹽水配制成1麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌懸液，備用。

1.4.2玻片氨基化 顯微鏡蓋玻片在250 g/L氫氧化鈉溶液中浸泡30 min，使玻片表面羥基化，依次用超純水、無水乙醇洗滌3次；再置于含有1% APTES的無水乙醇中，50 ℃溫育12 h，使玻片氨基化，分別用無水乙醇、MES緩沖液洗滌3次，備用。

1.4.3萬古霉素修飾玻片 萬古霉素與EDC以物質(zhì)的量之比1∶4溶于MES緩沖液(50 mmol/L，pH 6.0)，總體積為0.5 mL，活化15 min。將氨基化玻片置于其中，室溫反應(yīng)6 h后，用超純水洗滌3次。在EDC作用下，通過萬古霉素的羧基與玻片氨基共價結(jié)合，形成萬古霉素修飾玻片。利用傅里葉紅外光譜儀檢測羥基化玻片、氨基化玻片及萬古霉素修飾玻片的紅外特征峰。

1.4.4玻片表面萬古霉素含量測定 用紫外分光光度計分別檢測0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mg/mL萬古霉素溶液在260 nm波長的吸光度(A)值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測與玻片作用前后的萬古霉素溶液A變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算玻片表面偶聯(lián)萬古霉素含量。

1.4.5SERS光譜檢測 將制備的金黃色葡萄球菌溶液滴加于萬古霉素修飾玻片及空白玻片表面，37 ℃溫育1 h，PBS洗滌3次，晾干后滴加膠體銀納米懸浮液，干燥，并在掃描電子顯微鏡下觀察玻片捕獲金黃色葡萄球菌情況。用激光顯微拉曼光譜儀在633 nm激光下檢測空白萬古霉素修飾玻片、未滴加銀納米顆粒的金黃色葡萄球菌和滴加銀納米顆粒的金黃色葡萄球的表面增強(qiáng)拉曼光譜。

2 結(jié)果

2.1萬古霉素修飾玻片 傅里葉紅外光譜儀檢測結(jié)果顯示，萬古霉素修飾玻片在1 538 cm-1處具有苯環(huán)特征峰，與氨基化玻片在1 614 cm-1形成的氨基特征峰明顯區(qū)別，見圖1。偶聯(lián)前后溶液中萬古霉素的A差值ΔA=2.123-1.699=0.424，見圖2。繪制萬古霉素濃度與A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=2.257X+0.126(R2=0.994，其中Y指A，X指萬古霉素濃度)，見圖3，將ΔA代入回歸方程計算出偶聯(lián)至玻片的萬古霉素濃度為0.132 mg/mL，質(zhì)量為0.132 mg/mL×0.5 mL=0.066 mg，進(jìn)一步計算出每cm2玻片表面含有0.02 mg萬古霉素。

注：a，羥基化玻片的紅外光譜特征峰；b，氨基化玻片的紅外光譜特征峰；c，萬古霉素修飾玻片的紅外光譜特征峰。

2.2玻片捕獲金黃色葡萄球菌 玻片與金黃色葡萄球菌經(jīng)過溫育、洗滌，利用掃描電子顯微鏡分別對玻片的細(xì)菌捕獲能力進(jìn)行表征，結(jié)果顯示空白玻片無細(xì)菌黏附，而萬古霉素修飾玻片能夠結(jié)合較多數(shù)量的金黃色葡萄球菌，見圖4。

圖3 不同濃度萬古霉素溶液與紫外吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：A，未修飾萬古霉素玻片；B，萬古霉素修飾玻片。

2.3金黃色葡萄球菌SERS光譜的檢測 選擇激光顯微拉曼光譜儀的633 nm激光器，對玻片表面金黃色葡萄球菌的SERS光譜進(jìn)行檢測。與陰性對照相比，捕獲金黃色葡萄球菌后在724 cm-1、780 cm-1、1 001 cm-1、1 050 cm-1、1 100 cm-1、1 240 cm-1均出現(xiàn)特征峰。滴加銀納米顆粒的金黃色葡萄球菌SERS信號明顯高于未滴加銀納米顆粒的金黃色葡萄球菌的SERS信號。見圖5。

注：a，空白的萬古霉素修飾玻片的SERS光譜；b，萬古霉素修飾玻片捕獲金黃色葡萄球菌的SERS光譜；c，在銀納米顆粒的增強(qiáng)作用下，萬古霉素修飾玻片捕獲金黃色葡萄球菌的SERS光譜。

3 討論

本文制備的萬古霉素修飾玻片可從細(xì)菌懸液中捕獲、固定金黃色葡萄球菌，在銀納米顆粒的增強(qiáng)下，檢測出金黃色葡萄球菌SERS光譜，與Mosier-Boss[9]所述的檢測細(xì)菌SERS方法一致。在EDC的催化作用[7,10]，玻片表面成功修飾萬古霉素0.02 mg/cm2，即使經(jīng)3次標(biāo)準(zhǔn)洗滌，金黃色葡萄球菌仍黏附在萬古霉素修飾玻片表面，而空白玻片表面無細(xì)菌黏附。這是因為萬古霉素與金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁形成的氫鍵作用增強(qiáng)了基底捕獲細(xì)菌的能力。Liu等[11]也認(rèn)為萬古霉素修飾Ag/AAO納米基底顯著增強(qiáng)在液體中捕獲細(xì)菌的能力。

在本實驗中未捕獲細(xì)菌的萬古霉素修飾玻片的SERS光譜沒有明顯的特征峰，說明萬古霉素對金黃色葡萄球菌SERS光譜的背景干擾小。同時萬古霉素修飾玻片批量制備成本低、操作簡便，自特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌到檢測其SERS光譜約2 h，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)所需時間12～48 h相比，明顯縮短細(xì)菌檢測時間。因此，萬古霉素因其特異性、富集性、干擾性小、受水分子影響小等優(yōu)點，可以從溶液中直接富集金黃色葡萄球菌，并在不損壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行細(xì)菌SERS光譜的檢測，為直接從人體體液標(biāo)本中捕獲細(xì)菌并建立細(xì)菌SERS光譜奠定方法基礎(chǔ)。

本實驗檢測到金黃色葡萄球菌在724 cm-1、780 cm-1、1 001 cm-1、1 050 cm-1、1 100 cm-1、1 240 cm-1具有明顯的特征峰。細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖主要由N-乙酰胞壁酸(NAG)、N-乙酰葡萄糖胺(NAM)和L-氨基酸組成。Avci等[12]認(rèn)為724 cm-1歸屬富含N-乙酰胞壁酸的特征峰，1 240 cm-1歸屬酰胺Ⅲ，1 001 cm-1、1 050 cm-1歸屬苯丙氨酸。當(dāng)然細(xì)菌SERS光譜的起源尚有爭議，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌SERS光譜特征主要歸因于細(xì)菌細(xì)胞壁(肽聚糖、脂多糖、膜蛋白等)和細(xì)胞內(nèi)小分子的排泄[13-14]。Premasiri等[15]認(rèn)為細(xì)菌SERS光譜是由細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物而非細(xì)胞壁成分引起。從我們觀察到的金黃色葡萄球菌SERS特征峰，更傾向認(rèn)為細(xì)菌的SERS光譜起源于細(xì)菌細(xì)胞壁。

但因細(xì)菌SERS光譜影響因素較多，會因?qū)嶒灄l件的不同而有明顯的改變，如SERS活性底物和激發(fā)波長、細(xì)菌的生長周期及生長環(huán)境等都會影響SERS光譜的檢測[9]。因此，利用表面增強(qiáng)拉曼光譜儀檢測細(xì)菌光譜時需要建立同質(zhì)化、標(biāo)準(zhǔn)化的實驗條件以及各類細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)SERS光譜圖譜庫，以便SERS運用于細(xì)菌的鑒定。