柿葉主要成分及其在不同生長(zhǎng)時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化

劉瑞英，閆家蔭，段東喆，康明麗

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

柿葉（Diospyros kaki L.f.）是柿樹新鮮或干燥的葉子[1]?！侗静菥V目》記載：“味苦、性寒、無毒，治咳嗽吐血，止渴生津”[2]?！吨兴幋筠o典》記載：“酸、澀、涼”，可用于治療各種內(nèi)出血[3]。柿葉營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其以多酚、黃酮、VC、多糖等含量較高[4]。除以上外，柿葉中還含有蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、鈣、鐵等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。現(xiàn)代藥理研究表明[5]，柿葉中所含黃酮類、酚類、鞣質(zhì)類等化合物具有抗氧化、抗菌、止血、減肥降脂、降血糖、保護(hù)心血管等作用。

植物在生長(zhǎng)過程中體內(nèi)活性物質(zhì)的含量受到外界環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀況以及生理狀態(tài)等諸多因素影響，表現(xiàn)出一定的波動(dòng)規(guī)律，而且同種植物不同活性成分的動(dòng)態(tài)規(guī)律不同[6]。劉茂秀等[7]對(duì)庫爾勒香梨不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片營(yíng)養(yǎng)特征分析，結(jié)果表明香梨樹處于不同土壤質(zhì)地、不同季節(jié)條件下，其葉片營(yíng)養(yǎng)元素的組成及含量有顯著差異性。郝晴晴等[8]對(duì)國(guó)內(nèi)17種柿葉研究，結(jié)果表明柿葉多糖、黃酮、多酚、VC含量等與采摘期和品種有關(guān)。費(fèi)學(xué)謙等[9]研究也表明柿葉不同生長(zhǎng)期VC、總酚和黃酮含量有顯著差異性。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）可對(duì)植物葉片提取物成分準(zhǔn)確分析，提高植物成分的利用率。柿葉的乙醚提取物對(duì)酪氨酸酶具有較強(qiáng)的抑制作用，具有一定的美白功效[10]。崔翠等[11]研究發(fā)現(xiàn)柿葉中乙醇提取物對(duì)于思茅松毛蟲體內(nèi)的細(xì)菌有著極好的抑制作用，能夠破壞其新陳代謝系統(tǒng)，進(jìn)而起到防蟲作用。柿葉中還含有大量人體所需的礦物質(zhì)元素。柯范生等[12]對(duì)安溪油柿柿葉的營(yíng)養(yǎng)成分分析，發(fā)現(xiàn)安溪油柿柿葉含有豐富的礦物質(zhì)和微量元素。目前，柿葉主要研究也僅限于成分提取工藝優(yōu)化以及柿葉茶產(chǎn)品開發(fā)，不同生長(zhǎng)時(shí)期成分動(dòng)態(tài)變化鮮有研究，且對(duì)柿葉乙醇提取物成分和礦物質(zhì)元素研究更少。柿葉有效成分及其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能得到充分利用，通過對(duì)柿葉乙醇提取物、礦物質(zhì)元素及其成分動(dòng)態(tài)變化分析，為柿葉合理利用及產(chǎn)品研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料

采集自河北省石家莊市元氏縣石榴山莊50年左右樹齡大紅袍柿葉。每一單株選擇東南西北4個(gè)方位枝條葉片，每個(gè)方位取完整無蟲蛀葉片20片，每個(gè)時(shí)期共采集240片。采集日期為2018年4月至9月。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲醇（分析純）：天津市百世化工有限公司；無水碳酸鈉、考馬斯亮G-250（分析純）、抗壞血酸、鹽酸、牛血清蛋白（優(yōu)級(jí)純）：天津歐博凱化工有限公司；濃硫酸、蒽酮試劑（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林酚（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸（生化試劑）：阿拉丁試劑有限公司。

1.1.3 儀器

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；FA2204B電子天平：上海市安亭電子儀器廠；DHG-9003BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；C21-SDC8E15電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；Optima 7000DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀：美國(guó)PerkinElmer公司；410火焰原子吸收分光光度計(jì)：美國(guó)Shewood公司；FW-100高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE52-AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

樣品處理：將采摘的新鮮柿葉攤放2 h，放入烘箱內(nèi)，50℃烘干至恒重（約5 h）。粉碎過40目篩，備用。

1.2.2 醇溶性物質(zhì)測(cè)定

1.2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定乙醇提取物

樣品處理：準(zhǔn)確稱取1.000 0 g的柿葉（5月15日采摘）粉末，用50 mL無水乙醇加熱回流提取5 h，過濾，濾渣再用10倍無水乙醇回流提取1 h[13-14]。重復(fù)提取3次，合并濾液，減壓濃縮至2 mL，待測(cè)。

氣相色譜條件：柱子初始溫度50℃，保留3 min。以5℃/min升至150℃，保留3 min。再以10℃/min升至230℃，保留2.5 min。進(jìn)樣口溫度：250℃。質(zhì)譜連接線溫度：250℃；載氣（He）：1.0 mL/min；分流比：20 ∶1；進(jìn)樣量：1.0 μL[14-15]。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI源；電子能量：70 eV；電子源溫度：250℃；加速電壓：10kV；溶劑延遲時(shí)間：3min；掃描范圍：30 aum～1 000 aum[16]。

1.2.2.2 多酚含量測(cè)定

以沒食子酸為參比標(biāo)準(zhǔn)物，F(xiàn)olin-Denis法測(cè)定多酚含量。

1.2.2.3 黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為參比標(biāo)準(zhǔn)物，參考馬陶陶等[17]三氧化鋁比色法測(cè)定黃酮含量。

1.2.3 水溶性物質(zhì)測(cè)定

1.2.3.1 可溶性糖含量測(cè)定

參考梅為云等[18]方法測(cè)定可溶性糖含量。

1.2.3.2 VC含量的測(cè)定

參考劉紹雄等[19]紫外分光光度計(jì)快速測(cè)定法測(cè)定VC含量。VC測(cè)定原料為鮮葉。

1.2.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參考高國(guó)賦等[20]方法測(cè)定柿葉中蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 礦物質(zhì)元素含量測(cè)定

樣品前處理方法：稱取柿葉（5月15日采摘）粉末0.500 0 g（精確到0.000 1 g）置于錐形瓶中，放數(shù)粒玻璃珠，加10 mL混合酸（即硝酸8 mL，高氯酸2 mL），浸泡24 h。24 h后于電熱板上消解，先低溫40℃加熱1.5 h左右；升溫至90℃保持1 h；升溫至120℃保持3 h。若變棕黑色，再加混合酸，若不變色則無需加酸。繼續(xù)升溫至140℃～150℃保持1 h～2 h，最后升溫至180℃直至冒白煙（注意不要使液體蒸干），至消化液呈無色透明或略帶黃色，取下冷卻，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用水洗滌容器，將洗液合并于容量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。同法同時(shí)制備試劑空白溶液，并用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)小麥粉進(jìn)行質(zhì)量控制[21-23]。該方法中所用水均為超純水。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Micosoft Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05。使用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取物成分分析

總離子流圖見圖1，成分分析見表1。

圖1 柿葉乙醇提取物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow spectrograph of ethanol extract from persimmon leaves

表1 柿葉乙醇提取物成分分析表Table 1 Component analysis of ethanol extracts from persimmon leaves

續(xù)表1 柿葉乙醇提取物成分分析表Continue table 1 Component analysis of ethanol extracts from persimmon leaves

由圖1和表1分析結(jié)果可知，柿葉（5月15日采摘）乙醇提取物種類較多。圖1中各峰的鑒定主要通過NIST05譜庫檢索，并根據(jù)有機(jī)化合物的質(zhì)譜斷裂一般規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)分析確定，利用峰面積歸一化法計(jì)算峰面積的相對(duì)含量[24]。由表1可知，共鑒定出柿葉中含有28種化學(xué)成分，占總成分97.93%。從化合物類型來看，柿葉乙醇提取物主要成分是酸類、酯類和糖類。酸類含量最高占23.94%（樣品干重），主要成分是亞麻酸和棕櫚酸。酯類和糖類含量較高分別占23.0%和18.32%。從類別種類來看，糖類最為豐富，共檢測(cè)出8種糖類，其中蔗糖含量最高占5.65%。醛類和酯類分別檢測(cè)出5種。李羽晗等[5]對(duì)陜西榆林柿葉用柱色譜和重結(jié)晶法進(jìn)行分離純化，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定醇提取物，研究發(fā)現(xiàn)柿葉含有14種醇提取化合物。結(jié)果具有差異性原因可能與品種、環(huán)境因素和提取方法有關(guān)。

2.2 礦物質(zhì)元素含量分析

柿葉礦物質(zhì)元素成分分析見表2。

表2 柿葉礦物質(zhì)元素成分分析Table 2 Analysis of mineral elements in persimmon leaves mg/g

由表2可知，柿葉（5月15日采摘）共檢測(cè)出7種礦物質(zhì)元素，包括Ca、K、Mg 3種常量元素和Cu、Fe、Mn 3種微量元素，還有少量Al元素。柿葉中礦物質(zhì)元素含量大小順序是 Ca＞K＞Mg＞Al＞Fe＞Mn＞Cu。Ca元素含量最高，約為91.56 mg/g。K和Mg含量較高，約為23.85 mg/g和1.67 mg/g。Cu元素可以維持鐵的生理代謝。Fe參與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存，促進(jìn)人體的發(fā)育。Mn對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、膽固醇的合成、碳水化合物和脂肪代謝等都起著重要作用。與祖庸等[25]對(duì)陜西省商洛地柿葉采取火焰原子吸收法測(cè)定礦物質(zhì)元素的研究結(jié)果相近。柿葉可為人體提供生理所需的礦物質(zhì)元素。

2.3 不同生長(zhǎng)期黃酮含量的變化

不同時(shí)期柿葉黃酮含量見圖2。

圖2 不同時(shí)期柿葉黃酮含量Fig.2 Flavonoids in persimmon leaves at different stages

由圖2可看出不同生長(zhǎng)期柿葉黃酮含量變化趨勢(shì)。5月中旬含量最高，為12.14 mg/g。5月下旬至8月中旬黃酮含量呈顯著下降趨勢(shì)。柿樹5月開花，6月結(jié)果，7月～8月柿樹幼果迅速膨大，8月后柿果開始緩慢生長(zhǎng)。黃酮含量在8月初有所上升可能因?yàn)楣麑?shí)生長(zhǎng)緩慢，黃酮含量得到有效積累。在現(xiàn)有的研究中對(duì)柿葉黃酮?jiǎng)討B(tài)變化研究較少，主要集中在功能性及其提取方法的研究。從圖2中可以清晰看出黃酮含量在不同生長(zhǎng)時(shí)期的變化，為柿葉黃酮類產(chǎn)品開發(fā)和有效利用提供理論依據(jù)。

2.4 不同生長(zhǎng)時(shí)期柿葉多酚含量變化

不同時(shí)期柿葉多酚含量見圖3。

多酚是植物體內(nèi)重要活性物質(zhì)，具有多種保健功能，包括抗氧化、抑菌、降血脂和血糖，抗動(dòng)脈粥樣硬化等[26]。由圖3可知，柿葉不同生長(zhǎng)時(shí)期多酚含量變化趨勢(shì)，在5月中旬多酚含量達(dá)到最高水平，為224.49 mg/g。5月中旬后多酚含量呈顯著下降趨勢(shì)。因此，從多酚利用角度考慮，5月中旬是柿葉的最佳采收期。韓衛(wèi)娟等[27]對(duì)不同品種柿葉總酚含量年動(dòng)態(tài)變化分析表明，總酚在7～8月份含量達(dá)到最高水平。吳玉林等[28]對(duì)安溪油柿葉采用紫外分光光度法測(cè)定總酚含量在9月份達(dá)到最高水平。其結(jié)果有差異性，可能與品種、地理環(huán)境等因素有關(guān)。

圖3 不同時(shí)期柿葉多酚含量Fig.3 Polyphenol content in persimmon leaves at different stages

2.5 不同生長(zhǎng)時(shí)期柿葉VC含量變化

不同時(shí)期柿葉VC含量見圖4。

圖4 不同時(shí)期柿葉VC含量Fig.4 VCcontent in persimmon leaves at different stages

柿葉幾乎是所有植物葉中片中VC含量最高的[29]。從圖4中可以看出，不同生長(zhǎng)時(shí)期VC含量具有顯著性差異（P<0.05）。7月初VC含量達(dá)到最高水平，平均為19.15 mg/g。7月后VC含量顯著下降，9月初含量最低，為10.88 mg/g。郝晴晴等[8]采用紫外分光光度法測(cè)定17種國(guó)內(nèi)柿葉VC含量，結(jié)果分析表明5月VC含量達(dá)到最高水平。結(jié)果具有差異性，可能與品種、地理環(huán)境等因素有關(guān)。

2.6 不同生長(zhǎng)時(shí)期柿葉可溶性糖含量變化

不同時(shí)期柿葉可溶性糖含量見圖5。

圖5 不同時(shí)期柿葉可溶性糖含量Fig.5 Soluble sugar content in persimmon leaves at different stages

可溶性糖是柿葉甜醇滋味的重要組成成分，同時(shí)糖類物質(zhì)在熱加工過程中還可以轉(zhuǎn)化成香氣物質(zhì)，如甜香、薯香、焦糖香等[30]。由圖5可知，不同生長(zhǎng)時(shí)期可溶性糖有顯著差異性（P<0.05），柿葉可溶性糖含量全年在17.28 mg/g～55.96 mg/g波動(dòng)。5月含量最高，6月和8月含量較高。5～6月是柿葉生長(zhǎng)發(fā)育最快時(shí)期，柿樹6～8月開花并結(jié)果。開花期和柿果發(fā)育期生物量增加較快造成可溶性糖稀釋效應(yīng)，所以6月和8月可溶性糖含量低于5月份。

2.7 不同生長(zhǎng)時(shí)期柿葉蛋白質(zhì)含量變化

不同時(shí)期柿葉蛋白質(zhì)含量見圖6。

圖6 不同時(shí)期柿葉蛋白質(zhì)含量Fig.6 Protein content of persimmon leaves at different stages

由圖6可知，蛋白質(zhì)含量在生長(zhǎng)周期波動(dòng)比較大，并且不同生長(zhǎng)時(shí)期蛋白質(zhì)含量有顯著差異性（P<0.05）。8月中旬蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高水平4.66 mg/g。5月份出現(xiàn)增長(zhǎng)可能與季節(jié)性轉(zhuǎn)變和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。7～8月采摘區(qū)有三分之一雨期，7月含量升高可能是因?yàn)殛柟夂陀晁渥阌欣谑寥~營(yíng)養(yǎng)吸收。8月含量下降可能是因?yàn)楣麑?shí)積累抑制葉子營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。從蛋白利用角度考慮，8月初是柿葉的最佳采收期。

3 結(jié)論

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)柿葉乙醇提取物進(jìn)行分析，共鑒定28種化學(xué)成分，占總成分97.93%。酸類是構(gòu)成柿葉風(fēng)味的主要物質(zhì)，其次是酯類和糖類，分別占23.94%、23.0%和18.32%。柿葉中礦物質(zhì)元素含量大小順序是 Ca＞K＞Mg＞Al＞Fe＞Mn＞Cu。Ca元素含量最高，約為91.56 mg/g。不同生長(zhǎng)時(shí)期成分含量變化趨勢(shì)不同，8月中下旬蛋白質(zhì)含量最高，平均含量為4.66 mg/g。5月黃酮、多酚和可溶性糖含量最高，平均含量分別為224.49、14.02 mg/g和48 mg/g。7月初VC含量最豐富，平均含量為19.15 mg/g。結(jié)果表明，5月份適合加工成多酚、黃酮和可溶性糖功能性產(chǎn)品。7月適合加工為富含VC的功能性產(chǎn)品，8月適合加工成富含蛋白質(zhì)功能性產(chǎn)品。