隋志偉, 王 斌,, 劉思淵，王 晶,傅博強(qiáng)，卓婷燁, 王 義

(1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

1 引 言

枯草芽孢桿菌是一種廣泛分布于各種環(huán)境的生物防護(hù)細(xì)菌[1]，具有較強(qiáng)的分泌酶的特性，并且生長(zhǎng)快、營養(yǎng)簡(jiǎn)單、耐酸、耐高溫、耐膽鹽、能快速復(fù)活[2]，在發(fā)酵工藝、植物病害防治[3]、環(huán)境污染治理[4]、牲畜養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域都有著長(zhǎng)足的應(yīng)用價(jià)值?？莶菅挎邨U菌易培養(yǎng)、易保存，對(duì)人畜無毒無害，不產(chǎn)生環(huán)境污染，因此被作為理想的生物防護(hù)評(píng)價(jià)的指示菌。其中，枯草芽孢桿菌黑色變種ATCC9372為主要的應(yīng)用菌種。

枯草芽孢桿菌黑色變種寬0.5～1 μm，長(zhǎng)2～4 μm，在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基呈圓形、光滑、不透明、紅棕色或褐色菌落。由于枯草芽孢桿菌黑色變種ATCC9372所產(chǎn)芽孢在抗干熱等方面具有強(qiáng)抗性[5]，因此該菌在人員防護(hù)裝備性能評(píng)價(jià)、消毒劑檢測(cè)及滅菌質(zhì)量控制方面已作為國際質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)菌株被廣泛應(yīng)用。在美國、歐盟和我國的生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)中均規(guī)定了要用枯草芽孢桿菌黑色變種作為其性能評(píng)價(jià)的指示菌，主要應(yīng)用在人員防護(hù)、樣品保護(hù)和交叉污染三個(gè)方面的測(cè)試[6～8]。英國、瑞士和我國等國家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)將該菌作為干熱滅菌指示劑和其它液體化學(xué)消毒劑的指示劑列入與醫(yī)療器械相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)中。

枯草芽孢桿菌芽孢的精確定量測(cè)量是保證指示微生物量值準(zhǔn)確的關(guān)鍵。本研究針對(duì)枯草芽孢桿菌涂布平板法進(jìn)行了方法驗(yàn)證，同時(shí)選擇8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，建立了枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢測(cè)量方法，評(píng)價(jià)了方法的不確定度，為人員防護(hù)裝備防護(hù)性能評(píng)價(jià)、消毒劑檢測(cè)及滅菌質(zhì)量控制提供了計(jì)量技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

2.1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌黑色變種(bacillus subtilis var. niger)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC，菌株編號(hào)9372)由中國計(jì)量科學(xué)研究院保存?？莶菅挎邨U菌黑色變種芽孢方法驗(yàn)證樣品由中國計(jì)量科學(xué)研究院研制。

主要試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；HWS-400恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Milli-Q Advantage純水儀，美國Millipore公司；CP225D電子天平，德國Sartorius公司；移液器 (1 000 μL, 100 μL, 200 μL)，德國Eppendorf公司。

2.2 方法

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428—2010[9]，采用枯草芽孢桿菌涂布平板法測(cè)量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢濃度。

2.2.1 培養(yǎng)基制備

將胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基粉末加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH值(7.3±0.2)。分裝至錐形瓶中， 121 ℃高壓滅菌15 min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，搖勻后傾注平板。使用前在4 ℃冰箱儲(chǔ)存不得超過48 h。

2.2.2 樣品的稀釋

將待測(cè)枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢凍干樣品從4 ℃冰箱取出后，在室溫下放置5 min，用移液器加入60 mL無菌的磷酸鹽緩沖液作為稀釋液進(jìn)行復(fù)水溶解，充分混勻后制備成S0樣品勻液。再用1 mL移液器吸取S0樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中(注意吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支1 mL無菌吸頭反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:10的S1樣品勻液。再用稀釋液對(duì)充分溶解后的樣品S1在經(jīng)滅菌后的試管中進(jìn)行10倍系列稀釋，分別為S2，S3，S4，…，Sn，每遞增稀釋一次，換用一次1 mL無菌吸頭，混勻要充分。

2.2.3 樣品的接種

選擇3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，水浴(80±1)℃，維持10 min，每個(gè)稀釋度分別吸取100 μL樣品勻液接種于胰蛋白胨大豆瓊脂平板; 然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。涂布好的平板蓋好，置室溫中放置15 min，使接種物完全被瓊脂吸收; 然后將平板倒置于培養(yǎng)箱，每個(gè)稀釋度至少重復(fù)3次。

2.2.4 培養(yǎng)

涂布后，將平板靜置10 min后，將平板倒置于培養(yǎng)箱后，(37±1) ℃培養(yǎng)，(48±2) h。

2.2.5 典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

枯草芽孢桿菌黑色變種在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落基本上是表面粗糙、呈扁平同心圓狀的褐色或棕紅色菌落。選擇有典型的枯草芽孢桿菌黑色變種菌落且菌落數(shù)在30～300 CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)和記錄稀釋因子。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以芽孢濃度(CFU/mL)表示。

1) 若只有1個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在30～300 CFU之間,且有典型菌落; 計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：C為枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢濃度；N為某一平板上枯草芽孢桿菌黑色變種典型菌落的總數(shù)；m為適宜范圍菌落數(shù)的平板數(shù)；d為稀釋因子；V為平板上枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸浮液接種體積。

2) 若有2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在 30～300 CFU之間，按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：C為枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢濃度；N為某一平板上枯草芽孢桿菌黑色變種典型菌落的總數(shù)；m為第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n為第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子；V為平板上枯草芽孢桿菌黑色變種懸浮液接種體積。

2.3 枯草芽孢桿菌涂布平板法重復(fù)性驗(yàn)證

重復(fù)性被定義為在相同測(cè)量條件下，對(duì)同一被測(cè)量按方法規(guī)定的步驟，進(jìn)行多次連續(xù)測(cè)量所得結(jié)果之間的一致性。這些條件稱為重復(fù)性條件，它包括相同的測(cè)量程序、相同的觀測(cè)者、在相同的條件下使用相同的測(cè)量?jī)x器、相同地點(diǎn)、在短時(shí)間內(nèi)重復(fù)測(cè)量。按照第2.2節(jié)方法中的描述的實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)的枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢樣品采用涂布平板法進(jìn)行測(cè)量。重復(fù)性驗(yàn)證時(shí)，每天重復(fù)測(cè)試枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢樣品9次，連續(xù)測(cè)試5天，共得到45個(gè)測(cè)定結(jié)果，同時(shí)用無菌磷酸鹽緩沖液做空白對(duì)照，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)偏差s用式(3)計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD用式(4)計(jì)算。

(3)

(4)

2.4 枯草芽孢桿菌涂布平板法協(xié)同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照GB/T 6379.2—2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》[10]，選擇通過ISO 17025或CNAS-CL01:2006認(rèn)可，或經(jīng)計(jì)量認(rèn)證的8家實(shí)驗(yàn)室全部采用經(jīng)實(shí)驗(yàn)組織方確認(rèn)了的枯草芽孢桿菌涂布平板法進(jìn)行方法的協(xié)同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

8家實(shí)驗(yàn)室通過預(yù)實(shí)驗(yàn)的分析合格后，每家實(shí)驗(yàn)室收到由組織實(shí)驗(yàn)室發(fā)放的5瓶枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢樣品和標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)以及填寫結(jié)果報(bào)告的表格后，按照第2.2節(jié)方法中的描述分別開展協(xié)同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；并選擇3位具有微生物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)驗(yàn)的工作人員分別單獨(dú)計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型枯草芽孢桿菌黑色變種菌落，取平均值作為該平板的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過計(jì)算將實(shí)驗(yàn)結(jié)果返回實(shí)驗(yàn)組織方后統(tǒng)計(jì)分析，先對(duì)各家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)采用格拉布斯準(zhǔn)則進(jìn)行離群值檢驗(yàn)[11]；再用科克倫(Cochran)法檢查各組數(shù)據(jù)之間是否等精度[12]，采用式(5)計(jì)算室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用式(6)和式(7)計(jì)算室間標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用式(8)和式(9)計(jì)算重復(fù)性和再現(xiàn)性[13]。

(5)

室間變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差sl為：

(6)

室間標(biāo)準(zhǔn)偏差sR為：

(7)

方法的重復(fù)性r為：

(8)

方法的再現(xiàn)性R為：

(9)

2.5 枯草芽孢桿菌涂布平板法的不確定度評(píng)定

枯草芽孢桿菌涂布平板法的不確定度uchar由兩部分組成：第一部分是測(cè)量方法的A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA；第二部分是測(cè)量方法的B類標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB。

3 結(jié) 果

3.1 枯草芽孢桿菌涂布平板法室內(nèi)重復(fù)性分析

采用建立的枯草芽孢桿菌涂布平板法，重復(fù)測(cè)試枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢樣品9次，連續(xù)測(cè)定5天，共得到45個(gè)測(cè)定結(jié)果；同時(shí)用無菌磷酸鹽緩沖液做空白對(duì)照，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照式(3)和式(4)計(jì)算，結(jié)果見表1。

由表1可知，當(dāng)平板上的菌落數(shù)在 30～300 CFU之間時(shí)，該方法的室內(nèi)重復(fù)性為10.0%，滿足微生物定量測(cè)量方法<30%的要求[14]，說明枯草芽孢桿菌涂布平板法具有較好的重復(fù)性，能夠?qū)莶菅挎邨U菌黑色變種芽孢進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)量。

表1 枯草芽孢桿菌涂布平板法測(cè)量重復(fù)性結(jié)果(D=5，n=9)Tab.1 Repeatability of spread plate method for Bacillus subtilis (D=5, n=9) ×108 CFU/mL

3.2 枯草芽孢桿菌涂布平板法協(xié)同實(shí)驗(yàn)分析

當(dāng)平板上的菌落數(shù)在30～300 CFU之間時(shí)，該方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差sr為0.37×108CFU/mL，方法的重復(fù)性r為1.06×108CFU/mL，室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr 為8.9%，實(shí)驗(yàn)室間標(biāo)準(zhǔn)偏差sR為0.76×108CFU/mL，方法的再現(xiàn)性R為2.16×108CFU/mL，室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDR為14.1%，可以達(dá)到微生物定量測(cè)量方法精度<30%的要求[14]。

表2 枯草芽孢桿菌涂布平板法協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果(m=8，n=5)

3.3 枯草芽孢桿菌涂布平板法不確定度評(píng)定結(jié)果

枯草芽孢桿菌涂布平板法測(cè)量的不確定度主要由A類不確定度和B類不確定度組成[15, 16]。

3.3.1 A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)

A類不確定度分量uA是通過測(cè)量方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出的不確定度。采用枯草芽孢桿菌涂布平板法對(duì)枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢樣品重復(fù)測(cè)量9次。對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)采用格拉布斯準(zhǔn)則進(jìn)行離群值檢驗(yàn)和正態(tài)性分析后，再用科克倫(Cochran)法檢查各數(shù)據(jù)符合等精度要求，計(jì)算測(cè)量結(jié)果的算數(shù)平均值，用式(11)計(jì)算得出uA為0.15×108CFU/mL，A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度用式(12)計(jì)算，如表3所示為urel(A)=2.78%。

(11)

A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)為：

(12)

表3 枯草芽孢桿菌涂布平板法A類不確定度評(píng)定(n=9)Tab.3 Type A uncertainty evaluation of spread plate method for Bacillus subtilis (n=9) ×108 CFU/mL

3.3.2 B類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)

由式(1)或式(2)以及對(duì)測(cè)量過程的分析，B類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源包括[17, 18]：a)移液器帶來的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)；b)樣品稀釋因子帶來的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(d)。按照式(13)合成B類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表4。

(13)

3.3.3 合成不確定度urel(char)和相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel

考慮到兩部分標(biāo)準(zhǔn)不確定度相互獨(dú)立，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(char)用式(14)計(jì)算，相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel用式(15)計(jì)算，結(jié)果見表4。

(14)

Urel=k·urel(char)

(15)

表4 枯草芽孢桿菌涂布平板法不確定度評(píng)定結(jié)果Tab.4 Uncertainty evaluation results of spread plate method for Bacillus subtilis

4 結(jié) 語

本文針對(duì)枯草芽孢桿菌涂布平板法進(jìn)行了方法的室內(nèi)驗(yàn)證和多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同驗(yàn)證，當(dāng)平板上的菌落數(shù)在30～300 CFU之間時(shí)，該方法的室內(nèi)重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.0%，室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.1%，均達(dá)到了微生物定量測(cè)量方法精度<30%的要求，說明枯草芽孢桿菌涂布平板法具有很好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為12.0%。該方法適用于枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢的定量測(cè)量，對(duì)于人員防護(hù)裝備防護(hù)性能評(píng)價(jià)、消毒劑檢測(cè)及滅菌質(zhì)量控制具有重要意義。

致謝：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院、北京市疾病預(yù)防控制中心、北京市朝陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心、北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所、山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心、蘇州市計(jì)量測(cè)試院、國衛(wèi)康誠(北京)技術(shù)檢測(cè)有限責(zé)任公司、上海華證聯(lián)檢測(cè)科技有限公司對(duì)協(xié)同驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究工作提供了支持，謹(jǐn)致謝忱。