李偉 ,張海峰,王淼,霍靜,張穎,趙翠

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院全科醫(yī)療科，河北 承德 067000；2.解放軍第三〇九醫(yī)院心理醫(yī)學(xué)科，北京 100080）

睡眠剝奪是指一段時(shí)間內(nèi)完全缺乏或少于最佳睡眠的時(shí)間［1］。充足的睡眠是確保機(jī)體健康的基礎(chǔ)，睡眠剝奪會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，免疫功能下降，代謝性疾病、心血管疾病和癌癥等發(fā)生，嚴(yán)重者甚至可引起死亡［2］。研究［3］顯示：睡眠剝奪是心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，睡眠持續(xù)時(shí)間與心臟疾病的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，主要表現(xiàn)為氧化應(yīng)激損傷和心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。心肌內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)單核細(xì)胞黏附并聚集于細(xì)胞內(nèi)膜，誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）等的表達(dá)，參與組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［4］。黃芪是豆科植物黃芪和內(nèi)蒙黃芪干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)和利水消腫的功效［5］。研究［6］表明：黃芪制劑黃芪注射液有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、減少自由基生成和減輕組織炎癥反應(yīng)的活性。目前國(guó)內(nèi)已有研究［7］表明：黃芪注射液具有改善生化代謝作用，可通過(guò)減少腦組織氧自由基減輕睡眠剝奪對(duì)機(jī)體的損害。但近年來(lái)尚未發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對(duì)睡眠剝奪大鼠心臟保護(hù)作用的相關(guān)研究。本研究采用改良多平臺(tái)水環(huán)境法（modified multiple platform water environmental method，MMPWM）建立睡眠剝奪大鼠模型，觀察睡眠剝奪對(duì)大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo)的影響，探討黃芪注射液對(duì)大鼠心肌組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和主要儀器健康雄性SD 大鼠40 只，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-003。黃芪注射液購(gòu)自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z13020999，每毫升含2 g 生藥量；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州菲博生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素 6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒，B 淋巴細(xì)胞瘤2（B lymphoblastoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 及GAPDH 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。BX53 型奧林巴斯光學(xué)顯微鏡購(gòu)于鄭州朋來(lái)儀器有限公司，DR700 半自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立40 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低和高劑量黃芪注射液組，每組10 只。低和高劑量黃芪注射液組大鼠分別腹腔注射0.2 和0.8 mL·kg－1黃芪注射液，每天給藥1 次，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水1 mL·100 g－1，連續(xù)給藥2 周。2 周后，采用MMPWM 建立大鼠睡眠剝奪模型［8］。模型組和低及高劑量黃芪注射液大鼠組采用小平臺(tái)造模，其原理為：由于平臺(tái)（直徑6.5cm，高度8.0cm）較小，若大鼠進(jìn)入睡眠，會(huì)由于全身肌張力下降而導(dǎo)致垂頭觸水并驚醒，多次反復(fù)使得睡眠剝奪連續(xù)72 h。對(duì)照組采用大平臺(tái)，大鼠可自由活動(dòng)和休息。

1.3 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)取大鼠心臟，清洗，采用10%的甲醛浸泡固定48 h，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，進(jìn)行組織切片，切片厚度4 μm，清洗，采用蘇木精染色，清洗，采用1% HCl 的無(wú)水乙醇固定，用伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，包括大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞排列狀態(tài)、有無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及有無(wú)心肌間質(zhì)水腫。

1.4 TUNEL 法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）取大鼠心臟組織切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，脫蠟至水，PBS 緩沖液清洗，蛋白激酶K 工作液處理15 min，PBS 緩沖液清洗；加入山羊非免疫血清封閉30 min，去血清，加兔來(lái)源 cTnI 一抗（1 ∶100），于4℃過(guò)夜；室溫復(fù)溫后，PBS 緩沖液沖洗3 次，加入山羊抗兔FITC 二抗，置于濕盒中37℃避光孵育1 h，PBS 緩沖液沖洗3 次。加入新配制的TUNEL 反應(yīng)液，于37℃避光孵育1 h。陽(yáng)性對(duì)照加入100 μL DNase 1 室溫處理15 min，滴加熒光標(biāo)記dUTP 液，PBS 緩沖液清洗。采用100 μg·L－1DAPI 復(fù)染10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，封片液封片，共聚焦顯微鏡觀察，陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈棕褐色。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野，于400 倍顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算AI，AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/ 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）數(shù)×100%。

1.5 生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性各組大鼠在末次給藥后從眼眶后靜脈叢各取血5 mL，靜置1 h 后，離心并分離血清，采用DR700 半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性。

1.6 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平大鼠在末次給藥后用2%戊巴比妥鈉（0.3 mL·100 g－1）經(jīng)腹腔注射麻醉，取各組大鼠心肌組織稱質(zhì)量，按V∶W＝9∶1的比例加入生理鹽水，剪碎組織，冰上稀釋勻漿，離心并分離上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平。

1.7 ELISA 法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平剪碎大鼠心臟組織，冰上稀釋勻漿，離心并分離上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平收集各組大鼠待測(cè)心肌細(xì)胞，用RIPA 裂解細(xì)胞并提取總蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離各組蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF 膜。用5%BSA 封閉2 h 后更換為相應(yīng)的Bcl-2、Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 一抗，4℃孵育過(guò)夜。第2 天加入二抗室溫孵育1 h，最后加入顯色液于凝膠成像儀曝影。以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平＝目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠心肌細(xì)胞AI，血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性，心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA、IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平，均符合正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌間質(zhì)水腫，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，低劑量黃芪注射液組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，間質(zhì)水腫程度減輕；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞胞核大小均勻，無(wú)明顯水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞AI與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞AI 明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞AI 明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞AI 明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見(jiàn)表1 和圖2。

2.3 各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 水平均明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性均明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞AITab.1 AI of myocardiocytes of rats in various groups(n＝10,，η/%)

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞AITab.1 AI of myocardiocytes of rats in various groups(n＝10,，η/%)

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；＃P＜0.05 compared with low dose of Astragalus Injection group.

2.4 各組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性及MDA 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性明顯降低（P＜0.05），MDA 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.05）；與低劑量黃芪注射液組比較，高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 和GSHPx 活性明顯升高（P＜0.05），MDA 水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯降低（P＜0.05）；高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明顯低于低劑量黃芪注射液組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性Tab.2 Activities of serum LDH,CK,α-HBDH,and ALT of rats in various groups

2.6 各組大鼠心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量黃芪注射液組比較，高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中Bax、ICAM-1、VCAM-1 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3 和表3。

圖3 各組大鼠心肌組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of apoptosis-related proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 討論

睡眠剝奪類似于缺氧和低溫等刺激，可對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一系列的負(fù)向調(diào)控，如氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［1，9］、交感神經(jīng)激活［1，10］、血管內(nèi)皮功能紊亂［11］和內(nèi)分泌代謝紊亂［12］等，尤其是氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是睡眠剝奪影響心血管系統(tǒng)的重要因素。研究［1-2］顯示：睡眠剝奪不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成顯著影響，同時(shí)也與心血管疾病關(guān)系密切。流行病學(xué)研究［3］顯示：心血管疾病的發(fā)病率與睡眠持續(xù)時(shí)間有密切關(guān)聯(lián)，睡眠剝奪更被認(rèn)為是心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。黃芪在降血糖和血脂、抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗病毒、保護(hù)心血管系統(tǒng)、延緩衰老和提高機(jī)體免疫力等方面起到重要作用。但黃芪注射液對(duì)睡眠剝奪誘導(dǎo)心肌損傷的作用少有報(bào)道。本研究采用MMPWM 建立睡眠剝奪大鼠模型，探討黃芪注射液對(duì)睡眠剝奪誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。心肌酶主要包括LDH、CK、α-HBDH 和ALT，心肌組織損傷或壞死后心肌酶會(huì)不同程度地釋放到血液中，其活性可反映心肌細(xì)胞的受損程度［13-14］。本研究中，與模型組比較，低和高劑量黃芪注射液組大鼠血清中LDH、CK、α-HBDH 和ALT 活性均明顯降低，且高劑量黃芪注射液組大鼠血清中上述心肌酶活性下降更明顯，表明黃芪注射液可減少心肌酶的釋放，減輕心肌細(xì)胞的損傷，且其作用效果與劑量有關(guān)。ICAM-1 和VCAM-1 為炎癥主要黏附分子，主要在內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)。生理狀態(tài)下，ICAM-1 和VCAM-1 呈低水平表達(dá)，但受到各種炎癥因素刺激后其蛋白表達(dá)水平可上調(diào)［15］，導(dǎo)致組織器官結(jié)構(gòu)和功能的損傷。本研究中，睡眠剝奪模型大鼠心肌組織中ICAM-1 和VCAM-1 表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)白細(xì)胞集聚和黏附，引起多種炎癥因子釋放，IL-1β、IL-6和TNF-α 水平升高進(jìn)一步誘發(fā)微循環(huán)障礙，產(chǎn)生持續(xù)心肌損害。TNF-α 可通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)一步引起氧化應(yīng)激，IL-1β 及IL-6 是促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，可由TNF-α 誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)［16-17］。本研究中，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的釋放明顯減少；另一方面，ICAM-1 和VCAM-1的釋放亦會(huì)誘發(fā)自由基釋放增加，加劇心肌損傷；SOD 和GSH-Px 是機(jī)體中具有重要抗氧化作用的酶，其水平直接反映機(jī)體清除活性氧簇的能力［18-20］；MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物，其水平高低與機(jī)體內(nèi)自由基水平有關(guān)聯(lián)，主要反映機(jī)體受自由基損傷的程度［21-22］；本研究中，低和高劑量黃芪注射液組大鼠心肌組織中SOD 及GSH-Px 活性均不同程度升高、MDA 水平則明顯下降，表明黃芪注射液具有較好的抗氧化能力。黃芪還能上調(diào)大鼠心肌組織中抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，并下調(diào)促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 表達(dá)，表明黃芪注射液可減少心肌細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)睡眠剝奪大鼠心肌組織的作用，且高劑量黃芪注射液組大鼠心肌細(xì)胞損傷的改善情況優(yōu)于低劑量黃芪注射液組。

表3 各組大鼠心肌組織中ICAM-1、VCAM-1、Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of ICAM-1,VCAM-1,Bax,Bcl-2 and Caspase-3 protein in myocardium tissue of mice various groups

綜上所述，黃芪注射液可保護(hù)睡眠剝奪導(dǎo)致的大鼠心肌組織損傷，其作用機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激、下調(diào)黏附分子和凋亡蛋白表達(dá)、減少心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放有關(guān)，且在一定范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)依賴性。