王思桐?劉光焱?李培峰

摘要：目的：探索醇脫氫酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1）在植物乳酸桿菌中的基因克隆。方法：通過引物設(shè)計(jì)、酶的基因克隆、誘導(dǎo)表達(dá)三個(gè)部分來進(jìn)行醇脫氫酶的基因克隆工作。結(jié)果：1.通過在GeneBank中搜索相關(guān)醇脫氫酶基因，共計(jì)429條，利用Vector NTI軟件進(jìn)行同源比較，選取其中4條作為簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)基因來源，設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物。2.以植物乳酸桿菌Lactobacillus plantarum DNA為模板，PCR擴(kuò)增出其中的醇脫氫酶基因ADH，分別構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒Pet-22b和Pet-28a，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，表明在大腸桿菌DH5α中存在特異性條帶，且大小相符。

關(guān)鍵詞：植物乳酸桿菌;醇脫氫酶;PCR;誘導(dǎo)表達(dá)

醇脫氫酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1）的系統(tǒng)名為：醇：輔酶I氧化還原酶（Alcohol：NAD+，Oxidoreductase），大量存在于人和動(dòng)物肝臟[1-2]、植物及微生物細(xì)胞之中。ADH可以催化非常多的內(nèi)源性和外源性的有機(jī)底物的氧化反應(yīng)，扮演著重要的生理學(xué)角色。

1.實(shí)驗(yàn)方法

①根據(jù)GeneBank上已發(fā)表的ADH基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。②將四種乳酸桿菌（植物、嗜酸、干酪、保加利亞）進(jìn)行活化與培養(yǎng)，提取基因組DNA。③以四種乳酸桿菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。④提取質(zhì)粒 pET-22b（+）/pET-28a（+），將質(zhì)粒與目的片段進(jìn)行酶切與連接。⑤E.coli BL21（DE3）感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化，進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選與鑒定。⑥工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDA-PAGE檢測(cè)。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出高保守醇脫氫酶基因序列進(jìn)行簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)：

LP-ADH-001F：5-ATG AAA GCA GCA ACK TTT ATT G-3

LP-ADH-339R：5-G GTS RTT GTC AGT GAT ARA TAG-3

LP-ADH-088F：5-GGT TGT GGG CAC TGT GCC GCT TG-3

LP-ADH-256R：5-CC AAC AAC CGC ACC AGG ACG GCC-3

2.2從乳酸桿菌中克隆得到ADH基因

Agarose gel electrophoresis of ADH基因：1.植物乳酸桿菌;2.嗜酸乳酸桿菌;4.干酪乳酸桿菌;5保加利亞乳桿菌;7.植物乳酸桿菌中純化后目的片段;10.11.12.The plastmids of ADH;13.The plastmids of pET-22b（+）;3，6，8，9：DL5000。

2.3工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

2.4結(jié)果小結(jié)

利用PCR技術(shù)成功從植物乳酸桿菌中克隆得到ADH基因;克隆得到的基因成功連入原核表達(dá)載體pET-22b（+）并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中;工程菌通過IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)ADH基因。

3.討論

目前ADH的研究中存在著結(jié)構(gòu)資源有限、分子催化機(jī)理及手性識(shí)別規(guī)律尚不明晰、選擇性和適用性局限以及輔酶再生限制等問題。本研究以來源于植物乳酸桿菌的醇脫氫酶作為研究對(duì)象，通過分子生物學(xué)手段，克隆獲得醇脫氫酶基因并實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，以期大量獲得ADH，可以更加方便和大量得獲得單一的成分，然后對(duì)后續(xù)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究、找到活性、立體選擇性高的酶及更好的應(yīng)用提供依據(jù)，以便我們后續(xù)對(duì)酶進(jìn)行修飾與改造。

參考文獻(xiàn)：

[1]潘玲.枳黃方對(duì)酒精性肝損傷大鼠肝胃脂質(zhì)過氧化水平、肝乙醇脫氫酶ADH_1 mRNA的表達(dá)及NF-B、COX-2表達(dá)的影響[D].華中科技大學(xué)，2006.

[2]周寧.酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].浙江大學(xué)，2013.

通訊作者：劉光焱