CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用進(jìn)展

廖芳 王光銀

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)屬于一種基于古細(xì)胞抵御外源核算入侵的免疫機(jī)制為基礎(chǔ)開發(fā)出來的一種新型基因編輯技術(shù)，相對于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)而言，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具備操作簡單、效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)勢。當(dāng)前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤的研究和治療中已經(jīng)有一定的應(yīng)用。對此，本文簡要分析CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究及治療中的應(yīng)用進(jìn)展，希望能夠?yàn)橄嚓P(guān)工作者提供理論幫助。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯技術(shù);腫瘤;應(yīng)用進(jìn)展

引言

惡性腫瘤一直以來都是臨床中致死率最高的疾病，對于人們的生命安全危害顯著。按照國家癌癥中心發(fā)布的相關(guān)數(shù)據(jù)來看，我國惡性腫瘤每年新發(fā)病例在390萬左右，每年死亡人數(shù)約為230萬，并且癌癥負(fù)擔(dān)也在不斷提升，漲幅在3.9%左右，死亡率漲幅在2.5%左右，對于社會的危害顯著。惡性腫瘤主要是因?yàn)檫z傳、環(huán)境以及機(jī)體免疫等方面的因素共同作用而引發(fā)，發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前并不明確。另外，惡性腫瘤的治療主要是一放化療、手術(shù)治療為主，但是對于放化療的不耐受、晚期患者仍然沒有有效的治療方式，這也是惡性腫瘤患者治愈率不高的主要原因。對此，探討CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究和治療中的應(yīng)用進(jìn)展具備顯著實(shí)踐性價(jià)值。

1.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

按照核酸內(nèi)切酶的識別和切割機(jī)制的差異，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以劃分為2類5型，其中涉及到16個(gè)亞型。CRISPRRNA、反式激活CRISPRRNA、Cas9蛋白系統(tǒng)屬于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的主要構(gòu)成元素，在外源性DNA第一次入侵噬菌體和細(xì)胞時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會特異性的捕獲外緣DNA序列，此時(shí)會整合到細(xì)菌CIRSPR序列中并形成目標(biāo)位點(diǎn)下游的建個(gè)序列鄰近基序[1]。同一個(gè)外緣DNA在第二次進(jìn)入到細(xì)菌時(shí)，CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)錄生成前提CRISPRNRA，在RNaseIII的作用之下，可以被加工成為成熟的crRNA。crRNA的3′可以借助堿基互補(bǔ)的方式配對，引導(dǎo)Cas9蛋白快速聚集并形成CRISPR核糖核蛋白復(fù)合體。復(fù)合體當(dāng)中crRNA的5′末端特異性識別目標(biāo)序列，同時(shí)還能夠識別PAM的NGG位點(diǎn)。DNA在自我修復(fù)期間會優(yōu)先應(yīng)用容易失誤的非同源末端連接，錯(cuò)誤的使用堿基促使DAN發(fā)生圖阿扁，從而完成基因敲除目標(biāo)。在切割期間，PAM位點(diǎn)屬于識別位點(diǎn)，同時(shí)PAM位點(diǎn)還可以區(qū)別自身DNA和外緣性DNA，預(yù)防自身買內(nèi)衣的識別位點(diǎn)。伴隨著臨床研究的持續(xù)深入，研究人員開始應(yīng)用單鏈導(dǎo)向RNA替代crRNA和tracrRNA并形成R環(huán)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)Cas9蛋白對于目標(biāo)基因的定點(diǎn)切割。

2.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究和治療中的應(yīng)用

2.1腫瘤研究

在腫瘤的研究進(jìn)程當(dāng)中，應(yīng)用離題細(xì)胞培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)對腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究非常重要。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用可以為研究者提供一個(gè)更加快捷且方便的腫瘤細(xì)胞系的分析支持[2]。在早期的相關(guān)研究當(dāng)中，研究者主要是應(yīng)用Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)對DNA的靶切除，DNA雙鏈在斷裂之后會出現(xiàn)兩種不同的修復(fù)表現(xiàn)，分別為同源末端連接方式與非同源末端連接方式，其中非同源末端連接方式修復(fù)之后會出現(xiàn)插入與缺失突變的表現(xiàn)，此時(shí)會導(dǎo)致DNA雙鏈發(fā)生移碼突變或無意義突變，從而形成基因敲除的目標(biāo)。某研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)膠質(zhì)癌細(xì)胞的敲除分析，并呈現(xiàn)出高表達(dá)的Pyk2，實(shí)現(xiàn)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增值、遷移以及侵襲的表現(xiàn)，所以也證明了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對于膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展影響，有望成為膠質(zhì)瘤的治療新方向。為了更好的明確CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的有效性，在拓展CRISPR/Cas9系統(tǒng)其它方面的應(yīng)用方面，近些年有研究發(fā)現(xiàn)了Cas9蛋白的突變體屬于一種喪失了核酸酶禍心的Cas9蛋白，借助和DNA序列的結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄過程的抑制，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制性影響。這一種表現(xiàn)主要是以dCas9的CRISPR系統(tǒng)別稱為CRISPR干擾技術(shù)。該技術(shù)主要功能在于兩個(gè)方面，一方民事dCas9的介導(dǎo)抑制作用，另一方面是介導(dǎo)激活作用。應(yīng)用兩種功能可以為研究人員提供敲除基因和探究基因功能的支持，可以借助dCas9實(shí)現(xiàn)激活技術(shù)篩選以及鑒定原癌基因的表達(dá)，有利于新基因治療靶點(diǎn)的研究，可以作為未來腫瘤機(jī)制研究的重要方向。

2.2腫瘤治療

在基因修復(fù)和敲除方面，腫瘤細(xì)胞形成過程中原癌基因的激活和抑制基因的沉默均可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，在恢復(fù)與提升抑癌基因表達(dá)方面便成為了治療腫瘤的一個(gè)新思路。慢性髓系白血病的發(fā)生經(jīng)常和體內(nèi)抑癌基因的突變相關(guān)，同時(shí)也是決定患者預(yù)后效果的關(guān)鍵。應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對KBM5細(xì)胞當(dāng)中ASXLI的無效突變修復(fù)影響，從而實(shí)現(xiàn)對KBM5細(xì)胞的增值速率控制，提升細(xì)胞的分化表現(xiàn)，并通過ASXLI基因修復(fù)實(shí)現(xiàn)對癌癥小鼠生存時(shí)間的延長。另外，因?yàn)楸碛^遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的重要影響，可以借助表觀遺傳學(xué)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)對腫瘤發(fā)生的影響，所以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也可能會成為腫瘤治療的新手段。例如，在標(biāo)貫遺傳銹蝕和dCas9融合以及scRNA招募到目標(biāo)位點(diǎn)方面，可以借助改變目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)并以特定方式實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的修飾性影響，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療。

3.總結(jié)

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在腫瘤研究和治療方面的應(yīng)用價(jià)值顯著，潛力明確。但是，在工作中必須意識到，CRISPR/Cas9技術(shù)仍然存在許多無法解決的問題，例如脫靶效應(yīng)比較突出，在人體應(yīng)用方面的倫理與安全性問題仍未解決。但是，可以明確CRISPR/Cas9想該技術(shù)不斷發(fā)展的同時(shí)，必然可以解決各個(gè)方面的問題，從而有效應(yīng)用于腫瘤的研究與治療中，提供一個(gè)全新的干預(yù)路徑，為患者的綜合康復(fù)提供幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1]張騫，李力.CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在婦科惡性腫瘤研究及治療中應(yīng)用的進(jìn)展[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2018，53（1）：65-70.

[2]汪超甲，王輝.CRISPR/cas9基因編輯系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能及其在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2018，13（18）：244-245.

作者簡介：廖芳（1992.12-）女，湖南漣源人，研究生，單位：婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。