高效液相色譜法測(cè)定小麥粉及其制品中的間苯二酚

別 梅 宿書芳 武傳香 劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 濟(jì)南 250000)

間苯二酚(Resorcinol)是一種重要的化工原料，也是實(shí)驗(yàn)室中一種常用試劑[1]，已被證實(shí)為內(nèi)分泌干擾物，長(zhǎng)期接觸可導(dǎo)致皮炎、黏膜炎、驚厥和發(fā)紺等[2]問題。因此，在醫(yī)藥和化妝品產(chǎn)品中有著嚴(yán)格的使用限量[3]。在食品領(lǐng)域，GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將其列為允許使用的食品用合成香料，在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用。但依據(jù)原食藥總局關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)小麥粉質(zhì)量安全監(jiān)管的公告(2017年第132號(hào))，小麥粉中禁止添加過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚等非食品原料。因此，加強(qiáng)小麥粉中間苯二酚的使用監(jiān)管尤為重要。目前，小麥粉及其制品中間苯二酚的檢測(cè)鮮見方法標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道，不僅導(dǎo)致小麥粉及其制品生產(chǎn)企業(yè)在原料進(jìn)貨查驗(yàn)、出廠檢驗(yàn)等環(huán)節(jié)缺少高效、可靠的檢驗(yàn)方法，還影響食品藥品監(jiān)管部門對(duì)小麥粉及其制品生產(chǎn)企業(yè)的日常監(jiān)督檢查與風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)。綜上，研究建立小麥粉及其制品中間苯二酚的檢測(cè)方法意義重大。

已報(bào)道的測(cè)定間苯二酚的方法有分光光度法[5]、電化學(xué)法[6]、同步熒光法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9]、離子色譜法[10]和液相色譜法[11-15]等，其中液相色譜法最為普遍和可靠，檢測(cè)器多為紫外或熒光檢測(cè)器，在小麥粉中的檢測(cè)報(bào)道不多，而小麥粉制品中的使用鮮見報(bào)道，本研究將GB 2760—2014中小麥粉及小麥粉制品分類下的各個(gè)子類作為研究對(duì)象，建立一種通用的測(cè)定間苯二酚含量的高效液相色譜方法，采用二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器串聯(lián)檢測(cè)，有效避免了單一檢測(cè)器定性手段單一的問題，較為有效地減少假陽(yáng)性的存在，增強(qiáng)定性定量可靠性，方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、檢出限低，適用于小麥粉及其制品中痕量間苯二酚的定性、定量檢測(cè)，能滿足監(jiān)管需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇：色譜純、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅：優(yōu)級(jí)純、有機(jī)相微孔濾膜：0.22 μm。實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682—2016規(guī)定的一級(jí)水要求。

小麥粉、饅頭、油條、面條、炸雞粉：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，超聲清洗儀，離心機(jī)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，工作溶液用甲醇逐級(jí)稀釋。

1.4 樣品前處理

稱取5 g樣品于25 mL比色管中，加入15 mL甲醇渦旋混勻，超聲15 min, 加入1 mL亞鐵氰化鉀(0.25 mol/L)和1 mL乙酸鋅(1 mol/L),用甲醇定容至刻度，搖勻。于7 000 r/min離心3 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待上機(jī)。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18-Amide (3.5 μm,150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：A為水，B為甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；二極管陣列檢測(cè)器(PDA)串聯(lián)熒光檢測(cè)器，PDA檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)273 nm，發(fā)射波長(zhǎng)304 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道中，間苯二酚的分離測(cè)定多使用C18柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間苯二酚在常規(guī)C18柱上出現(xiàn)峰拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致分離度降低、靈敏度減弱，精密度變差，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過比較發(fā)現(xiàn)，C18-Amide柱能有效解決間苯二酚的拖尾問題。比較了C18柱和C18-Amide柱的峰形(圖1)，在測(cè)試液濃度為10 μg/mL時(shí)，C18柱色譜峰拖尾因子為1.768，而C18-Amide的拖尾因子為1.082，拖尾因子明顯降低，峰形對(duì)稱良好。這是因?yàn)镃18-Amide柱是一種復(fù)合作用模式的色譜柱，在C18疏水作用的基礎(chǔ)上，鍵合的酰胺基可以增加極性化合物的保留并提供替代選擇性，從而改善了含酚羥基等極性基團(tuán)的化合物的保留。實(shí)驗(yàn)最終選擇C18-Amide為間苯二酚的分離色譜柱。實(shí)驗(yàn)還考察了不同流動(dòng)相條件對(duì)間苯二酚的保留行為的影響。分別以甲醇/水、乙腈/水、甲醇/醋酸銨(20 mmol/L)、乙腈/醋酸銨(20 mmol/L)為流動(dòng)相，考察間苯二酚的保留及分離情況。結(jié)果表明，幾種流動(dòng)相條件下峰形和保留均無明顯差別。從經(jīng)濟(jì)角度及操作實(shí)用性等方面考慮，選擇甲醇/水作為流動(dòng)相。

圖1 不同色譜柱的峰形比較

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用PDA檢測(cè)器，提取間苯二酚的光譜圖(圖2)，由圖2可以看出，目標(biāo)物在196.7 nm和273.4 nm處有最大吸收和特征吸收。由于196.7 nm波長(zhǎng)較短，干擾較多，故選擇273 nm為PDA檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)以及熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)。固定激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在304.7 nm處熒光響應(yīng)最強(qiáng)(圖3)。因此確定熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)λex為273 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)λem為304 nm。

圖2 間苯二酚在190-750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖

圖3 激發(fā)波長(zhǎng)273 nm時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)掃描圖

2.1.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

間苯二酚易溶于水、甲醇、乙醚等溶劑。小麥粉及其制品多為高淀粉基質(zhì)，若直接以水為提取劑，樣品的分散性較差，回收率較低。實(shí)驗(yàn)分別以不同比例的甲醇/水為提取劑，比較不同提取劑的提取回收率，間苯二酚的回收率隨甲醇濃度增高而增高，當(dāng)甲醇比例到達(dá)80%后，回收率趨于穩(wěn)定。由于饅頭、面條等小麥粉制品吸水性較強(qiáng)，從精準(zhǔn)定量的角度，選擇純甲醇為最優(yōu)的樣品提取劑。

實(shí)驗(yàn)考察了前處理沉淀劑對(duì)目標(biāo)物回收率及凈化效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加與不加亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀劑對(duì)回收率及色譜峰均無明顯差異。但是不經(jīng)沉淀處理的樣品溶液，在冷藏或長(zhǎng)時(shí)間放置后會(huì)析出沉淀物，不利于批量樣品的同時(shí)測(cè)定。而經(jīng)沉淀處理的樣品溶液不因放置時(shí)間的長(zhǎng)短而出現(xiàn)沉淀物。因此，批量測(cè)定時(shí)，在不能保證立即進(jìn)行儀器分析的情況下，加入沉淀劑可保證溶液在冷藏條件下較長(zhǎng)的時(shí)間保持澄清透明。

2.2 方法學(xué)性能考察

2.2.1 方法的線性和檢出限

將間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋至0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1、5、10 μg/mL，并依次注入液相色譜儀，以峰面積和測(cè)試液濃度做曲線。檢出限和定量限為色譜圖信噪比(S/N)等于3和10時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品中間苯二酚的含量。兩種檢測(cè)器的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。結(jié)果顯示兩種檢測(cè)器在各自的線性范圍內(nèi)線性良好，且熒光檢測(cè)器的靈敏度更高。

表2 兩種檢測(cè)器的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限

2.2.2 方法的準(zhǔn)確性與精密度

選取小麥粉及其制品(自發(fā)粉、鮮面條、干面條、饅頭、裹粉和油條)，分別加入一定量的間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，考察方法的回收率及精密度并對(duì)比兩種檢測(cè)器共有的線性范圍內(nèi)的(加標(biāo)水平為1 mg/kg和2 mg/kg)樣品的PDA定量結(jié)果和熒光定量結(jié)果。

加標(biāo)量為0.05、0.1、和0.5 mg/kg的樣品以熒光檢測(cè)器的定量結(jié)果來計(jì)算回收率，加標(biāo)量為1、2和10 mg/kg的樣品以PDA檢測(cè)器的定量結(jié)果來計(jì)算。小麥粉樣品的回收率在90.3%～103.2%之間，其他樣品的回收率也均在73%～108.6%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.2%。結(jié)果見表3。

在GB 27404—2008檢測(cè)方法的確認(rèn)要求中規(guī)定，加標(biāo)量在1～10 mg/kg之間，回收率范圍為90%～110%；在0.1～1 mg/kg之間，范圍為80%～110%；加標(biāo)量<0.1 mg/kg時(shí)，回收率范圍在60%～120%之間。本方法的回收率除加標(biāo)水平為0.05 mg/kg的樣品的回收率在60%～120%之間外，其他加標(biāo)水平的樣品的回收率均在90%～110%之間。GB 27404中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)隨待測(cè)組分含量的增加而減小，當(dāng)待測(cè)組分的含量為0.1 mg/kg時(shí)RSD<15%，10 mg/kg時(shí)RSD<7.5%,方法最低加標(biāo)量0.05 mg/kg的RSD為4.5%～8.2%,其他加標(biāo)水平的RSD<5.5%。結(jié)果表明，方法的回收率和精密度均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。加標(biāo)水平為1 mg/kg和2 mg/kg的每一個(gè)樣品的PDA定量結(jié)果和熒光定量結(jié)果經(jīng)過比對(duì)，其偏差的絕對(duì)值均小于5.2%，差異較小。

表3 不同樣品添加回收率與精密度

2.2.3 方法的特異性

為考察方法的特異性，對(duì)空白樣品和加標(biāo)樣品按照相同的前處理和儀器條件進(jìn)行分析，得到的譜圖(圖4)表明，在間苯二酚保留時(shí)間處沒有明顯的干擾峰。實(shí)驗(yàn)還考察了間苯二酚兩種同分異構(gòu)體鄰苯二酚和對(duì)苯二酚對(duì)目標(biāo)物的干擾情況，發(fā)現(xiàn)在本方法建立的流動(dòng)相條件下，三種同分異構(gòu)體能有效分離，其分離色譜圖見圖5。綜上，方法的特異性較強(qiáng)，有效避免了復(fù)雜基質(zhì)中假陽(yáng)性的影響。

圖4 間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、空白樣品和空白樣品加標(biāo)色譜圖

圖5 苯二酚三種同分異構(gòu)體的分離色譜圖

2.3 方法的應(yīng)用

方法的檢測(cè)器采用二極管陣列和熒光檢測(cè)器串聯(lián)，間苯二酚測(cè)試液濃度在兩者共同的線性范圍內(nèi)時(shí)兩種檢測(cè)器可以同時(shí)用于定量，差別不大，在定性時(shí)根據(jù)目標(biāo)峰在兩個(gè)檢測(cè)器采集的譜圖的同一保留時(shí)間處是否同時(shí)出現(xiàn)相互佐證；測(cè)試液濃度超出熒光檢測(cè)器的線性范圍但在PDA檢測(cè)器的線性范圍之內(nèi)的可用PDA定量，目標(biāo)物的紫外吸收光譜圖和熒光檢測(cè)器的譜圖輔助定性，或者稀釋至兩種檢測(cè)器共同的線性范圍；熒光檢測(cè)器靈敏度高，適用于含量<1 mg/kg的樣品的檢測(cè)，但濃度低于PDA的檢出限時(shí)，定性方式也較單一。

對(duì)購(gòu)買自超市和網(wǎng)絡(luò)兩種渠道不同品牌的小麥粉、面條、饅頭等樣品共計(jì)50批次，按本方法建立的前處理方法進(jìn)行處理與上機(jī)測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)間苯二酚陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本方法建立了高效液相色譜-PDA-熒光串聯(lián)法測(cè)定小麥粉及其制品本方法中間苯二酚的含量，二極管陣列和熒光檢測(cè)器的定量結(jié)果均具備良好特異性，且在各自線性范圍內(nèi)r2>0.999，定量限分別為1 mg/kg和0.05 mg/kg，回收率73.0%～108.6%，RSD<8.2%，兩種檢測(cè)器的定量結(jié)果偏差<5.2%。方法操作簡(jiǎn)單、線性良好、準(zhǔn)確度高，兩種檢測(cè)器串聯(lián)使用，增加了定性定量的準(zhǔn)確性。該方法為小麥粉及其制品的監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供有效的技術(shù)支持，也為今后小麥粉及其制品加工過程中間苯二酚含量變化趨勢(shì)研究提供參考。