李海銀 常加富 呂文欣 李 峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院， 青島 266109)

1 引 言

近年來，大量研究表明，癌胚抗原(CEA)的表達與肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等眾多疾病相關(guān)，被認為是具有臨床診斷價值的腫瘤標志物之一[1,2]。靈敏與準確檢測生物體內(nèi)CEA的表達對相關(guān)疾病的早期診斷與有效治療具有重要的研究價值與現(xiàn)實意義。但是，生物體內(nèi)CEA的檢測存在表達水平低、干擾物質(zhì)多等難點，對發(fā)展新型高性能的CEA傳感器提出了更嚴格的要求。目前，比色法[3,4]、化學(xué)發(fā)光法[5,6]、熒光法[7,8]、電化學(xué)方法[9,10]、拉曼光譜法[11,12]等技術(shù)均已被用于構(gòu)建CEA傳感器，其中，熒光法因具有簡單、快速、靈敏等優(yōu)點而備受關(guān)注，被認為是實現(xiàn)生物體內(nèi)CEA靈敏與準確檢測的理想手段。然而，目前報道的CEA熒光生物傳感器面臨很多因素限制：(1)信號單元多為羅丹明、熒光素、青色素、金屬簇等[13～15]，穩(wěn)定性不佳、發(fā)光效率低、抗光學(xué)漂白性不強，存在嚴重的聚集誘導(dǎo)淬滅效應(yīng); (2)大多數(shù)信號分子均需標記[16,17]，該過程需要嚴格控制實驗條件，耗時、費力、復(fù)雜、繁瑣，導(dǎo)致探針的構(gòu)建成本高; (3)碳點與量子點雖可作為信號源實現(xiàn)CEA的免標記熒光檢測[18,19]，但碳點的低發(fā)光效率與弱穩(wěn)定性、量子點的高毒性嚴重限制了其在CEA免標記檢測中的廣泛應(yīng)用。因此，設(shè)計高性能的新型信號分子、發(fā)展新型免標記的分析策略，對構(gòu)建用于檢測生物體內(nèi)CEA的傳感平臺具有重要意義。

聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)材料，稀溶液時不發(fā)光，聚集態(tài)下強烈發(fā)光，易于化學(xué)修飾剪裁，具有較強的抗光學(xué)漂白能力和較高的熒光量子產(chǎn)率，廣泛應(yīng)用于有機電致化學(xué)發(fā)光[20]、細胞成像[21]、腫瘤治療[22]、分析傳感檢測[23]等方面，并取得了一系列重要的研究成果。發(fā)展以AIE材料作為信號分子的生物傳感平臺有望解決傳統(tǒng)熒光信號分子性能低的關(guān)鍵技術(shù)難題，極大地提高檢測靈敏度、選擇性與準確性,受到了研究者的廣泛關(guān)注。Lu等[24]以AIE材料作為信號源制備了用于檢測K+的熒光探針，并進一步將其用于細胞內(nèi)K+的原位成像; Zhuang等[25]設(shè)計并合成了陽離子AIE染料TPE-Py，基于目標物延長端粒的特性，實現(xiàn)了端粒酶的靈敏、特異性檢測與細胞內(nèi)原位成像。文獻報道的設(shè)計策略主要有兩種：AIE分子與核酸鏈的化學(xué)標記、陽離子AIE染料與核酸鏈的靜電吸附。利用靜電吸附策略雖可解決標記的難題，但陽離子AIE染料穩(wěn)定性差，易受到生物體內(nèi)陰離子的干擾，降低檢測的準確度。目前，基于AIE材料構(gòu)建用于CEA分析檢測的傳感平臺未見有文獻報道。

本研究以弱發(fā)光的馬來酰亞胺功能化的四苯乙烯(TPE-M)作為信號源，基于酶輔助的循環(huán)放大反應(yīng)，在L-半胱氨酸(L-Cys)存在下，實現(xiàn)了CEA的免標記、高靈敏熒光檢測。L-Cys與TPE-M反應(yīng)，促使其熒光增強。目標物CEA識別發(fā)夾HP，改變其構(gòu)型，進一步引發(fā)聚合酶與內(nèi)切酶輔助的循環(huán)放大反應(yīng)，生成大量Hemin/G-四鏈體，可催化氧化L-Cys變成胱氨酸(Cys-cys)，而Cys-cys無法與TPE-M反應(yīng)點亮其熒光。利用CEA加入前后，溶液中不同濃度的L-Cys與TPE-M反應(yīng)導(dǎo)致的熒光強度的變化，實現(xiàn)體系中目標物的免標記、高靈敏檢測。本研究將AIE材料集成于免標記檢測CEA的生物傳感平臺中，方法簡單、快速、靈敏，具有重要的實際應(yīng)用價值。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F-4600熒光光譜儀(日本日立公司); Gel Doc XR + 凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

Klenow fragment聚合酶(KF聚合酶)、單核苷酸(dNTPs)、RNase抑制劑與三(羥甲基)甲基氨基甲烷(Tris)均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。癌胚抗原(CEA)及其干擾物(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司); 核酸切割酶Nt.BbvCl(美國新英格蘭生物實驗室); 其它試劑購自上海安耐吉化學(xué)公司。Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0，含有10 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2)與1.0 mmol/L二硫蘇糖醇，用于本實驗中DNA溶液的配制。信號分子TPE-M參考文獻[26,27]報道的方法合成，溶于乙腈，制備成濃度為400 μmol/L 的溶液。實驗中所用的核酸片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 本實驗所用核酸序列

2.2 CEA的免標記熒光檢測

將HP溶液在95℃孵育5 min，自然冷卻至室溫，備用。50 μL含有400 nmol/L HP、400 nmol/L P1、1.2 U/μL KF聚合酶、0.8 U/μL Nt.BbvCl、2000 μmol/L dNTPs和不同濃度CEA的溶液在25℃下反應(yīng)120 min，隨后升溫至90℃反應(yīng)10 min。冷卻后，向其中加入含有8.0 μmol/L Hemin的50 μL Tris-HCl緩沖溶液，并繼續(xù)反應(yīng)45 min; 接著向其中加入含有200 μmol/L Cys的20 μL Tris-HCl緩沖溶液，反應(yīng)30 min后，將10 μL TPE-M(400 μmol/L)溶液、70 μL Tris-HCl緩沖溶液與上述反應(yīng)溶液混合，繼續(xù)孵育20 min，進行熒光分析檢測。熒光測量電壓為700 V，激發(fā)波長為365 nm，狹縫為5.0 nm，光譜采集范圍為400～650 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 TPE-M/L-Cys熒光傳感體系的構(gòu)建與表征

對制備的TPE-M的熒光性能及TPE-M對L-Cys的熒光響應(yīng)特性進行了考察。如圖1A所示，受限于馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)的強吸電子能力，TPE-M發(fā)光較弱，其熒光強度僅為57.60 a.u.。向其中加入L-Cys后，熒光強度大大增加，達到517.3 a.u.。從熒光照片中可更直接地觀察到熒光強度的增加：TPE-M溶液幾乎無熒光，而TPE-M+L-Cys溶液則發(fā)射出強烈的天藍色熒光。上述結(jié)果均表明，TPE-M對L-Cys有優(yōu)異的響應(yīng)性?；诩尤隠-Cys后TPE-M的熒光強度顯著增加的特性，并參考文獻[28]，推測TPE-M與L-Cys作用機理如圖1B所示：L-Cys分子上的巰基與TPE-M上馬來酰亞胺的雙鍵發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，生成穩(wěn)定的加成物TPE-M-L，雙鍵被破壞，抑制了分子內(nèi)的光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移(PET)，促使熒光增強。

Hemin/G-四鏈體具有類辣根過氧化物酶活性[29,30]，可催化體系中的溶解氧氧化L-Cys為Cys-cys。Cys-cys相對L-Cys而言不含巰基，因此無法破壞TPE-M上馬來酰亞胺的雙鍵增強體系中的熒光信號(圖1C)?；贖emin/G-四鏈體對L-Cys的催化氧化作用、TPE-M對L-Cys響應(yīng)以及L-Cys與Cys-cys的分子結(jié)構(gòu)差異，推測TPE-M/L-Cys體系對G-四鏈體DNA有特異的響應(yīng)性。為驗證此推測，將G-四鏈體DNA(G1)與非G-四鏈體DNA(N1)分別與L-Cys進行預(yù)孵育，然后再與TPE-M進行反應(yīng)，結(jié)果如圖1D所示。當(dāng)G1與N1均不存在時，體系熒光信號較高，且其強度隨預(yù)孵育時間變化很小; 當(dāng)G1存在時，隨著孵育時間延長，熒光強度逐漸降低，在30 min時達到最低值; 當(dāng)N1存在時，隨著時間延長，檢測體系熒光強度保持穩(wěn)定，沒有發(fā)生變化。實驗結(jié)果表明，TPE-M/L-Cys體系可特異性地識別G-四鏈體DNA。

圖1 (A)不同體系的熒光光譜(插圖為相應(yīng)的熒光照片)：(a)TPE-M，(b)TPE-M + L-Cys; (B)L-Cys與TPE-M的反應(yīng)路線; (C)Hemin/G-四鏈體對TPE-M/L-Cys作用的示意圖; (D)L-Cys與空白樣品(a)、 G1(b)、 N1(c)預(yù)孵育后與TPE-M反應(yīng)體系熒光強度隨預(yù)孵育時間的變化Fig.1 (A) Fluorescent spectra of different systems: (a) maleimide-functionalized tetraphenylethene (TPE-M), (b) TPE-M +L-Cys, and inset is images of (a) and (b) under excitation of 365 nm light; (B) Reaction route of L-Cys and TPE-M; (C) Interaction illustration of TPE-M + L-Cys with hemin/G-quadruplex; (D) FL intensity of the sensing system in the presence of TPE-M versus pre-reaction time between: (a) L-Cys+ blank, (b) L-Cys + G1, and (c) L-Cys + N1

3.2 實驗原理

圖2 基于TPE-M/L-Cys體系免標記、高靈敏檢測 CEA的原理圖Fig.2 Principle of TPE-M/L-Cys based biosensor for carcinoembryonic antigen (CEA) analysis based on target-initiated cyclic amplification reaction

基于上述實驗結(jié)果，借助酶輔助的循環(huán)放大反應(yīng)，將TPE-M/L-Cys體系用于檢測CEA，其實驗原理如圖2所示。首先，設(shè)計發(fā)卡探針HP與模板探針P1序列，以保證目標物存在條件下指數(shù)擴增反應(yīng)的順利進行。HP分為3個部分：Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ，其中，Ⅰ與Ⅱ為CEA的適配體序列，可特異性識別結(jié)合CEA; Ⅲ與P1中的Ⅰ*或Ⅱ*互補; Ⅰ與Ⅲ為發(fā)卡HP的莖，Ⅱ為發(fā)卡HP的環(huán)。P1被Nt.BbvCI內(nèi)切酶識別位點(5′-GCTGAGG-3′)分為3個部分：Ⅰ*、Ⅱ*與Ⅲ*，其中Ⅰ*與Ⅱ*相同，Ⅲ*與G1互補。當(dāng)目標物不存在時，HP保持發(fā)卡構(gòu)象，與P1 不發(fā)生反應(yīng)(圖3A-a, b, c)，因此無法引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)生成大量Hemin/G-四鏈體，也無法阻止L-Cys與TPE-M反應(yīng)，故檢測體系發(fā)出強烈的熒光信號。當(dāng)CEA存在時，CEA與HP中Ⅰ與Ⅱ特異性結(jié)合形成CEA@HP絡(luò)合物，引發(fā)HP構(gòu)象變化，暴露出片段Ⅲ(圖3A-d)。暴露出的片段Ⅲ與模板P1雜交生成新的絡(luò)合物，因此，CEA@HP絡(luò)合物對應(yīng)的條帶消失，同時在其后出現(xiàn)一個新的條帶(圖3A-e)。加入KF聚合酶和Nt.BbvCI內(nèi)切酶后，引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)，合成出大量s1與s2核酸片段，同時釋放出CEA。其中，生成的s1與未反應(yīng)的P1繼續(xù)雜交，釋放的CEA繼續(xù)識別未反應(yīng)的HP，新引發(fā)若干個指數(shù)擴增反應(yīng)，生成大量核酸片段s2。因此，在泳道f最前方出現(xiàn)一個新的條帶，與G1條帶的位置相當(dāng)，進一步證實了富含G堿基的s2核酸片段的生成。在K+與Hemin存在下，s2形成大量Hemin/G-四鏈體，催化氧化L-Cys變成Cys-cys，阻止L-Cys與TPE-M的反應(yīng)，致使熒光信號降低。

3.3 可行性分析

為驗證所設(shè)計的傳感器用于CEA免標記分析檢測的可行性，測定了不同體系的熒光響應(yīng)(圖3B)。當(dāng)CEA不存在時，L-Cys與TPE-M反應(yīng)，產(chǎn)生較強的熒光信號(516.9 a.u.)，其與TPE-M/L-Cys體系的熒光強度相當(dāng)，表明溶液中存在的DNA片段、生物酶、核苷酸、Hemin等對TPE-M/L-Cys體系的影響非常小。加入10 fmol/L CEA后，體系的熒光強度降低至271.8 a.u.，這主要歸因于CEA引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)生成大量Hemin/G-四鏈體，進而催化氧化L-Cys，阻止其與TPE-M的反應(yīng)，降低熒光強度。繼續(xù)增加CEA濃度至200 fmol/L，熒光強度繼續(xù)降低，表現(xiàn)出明顯的負相關(guān)關(guān)系，進一步證實了實驗原理的可行性：越多的L-Cys引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)生成越多的s2，催化消耗越多的L-Cys，進而大幅度降低熒光信號。上述實驗結(jié)果表明，基于TPE-M/L-Cys體系構(gòu)建免標記傳感平臺用于CEA的熒光分析檢測是可行的。

HP與P1不僅具有識別CEA的功能，同時也有保證指數(shù)擴增反應(yīng)順利進行的作用。因此，利用HP′和P1′分別取代HP和P1構(gòu)建傳感體系，考察傳感體系對CEA的熒光響應(yīng)行為(圖3C)。HP′不含有CEA適配體序列，P1′不含有與G1互補的序列。當(dāng)HP′取代HP后，檢測體系呈現(xiàn)較強的熒光信號，遠大于HP構(gòu)建的 傳感器檢測到的熒光強度。這主要是因為HP′無法識別CEA，因此構(gòu)象不發(fā)生變化，無法引發(fā)循環(huán)放大反應(yīng)產(chǎn)生G-四鏈體，也不能阻止L-Cys與TPE-M的反應(yīng)。當(dāng)用P1′代替P1后，檢測體系的熒光信號依然很高，大于P1存在時體系的熒光強度。這主要是因為HP雖可識別CEA引發(fā)循環(huán)放大反應(yīng)產(chǎn)生大量核酸片段，但產(chǎn)生的核酸片段不是G-四鏈體DNA，因此無法形成Hemin/G-四鏈體進而阻止L-Cys與TPE-M的反應(yīng)。因此，合理、巧妙地設(shè)計HP和P1的核酸序列才能保證CEA免標記檢測的順利進行。

3.4 實驗條件優(yōu)化

Hemin/G-四鏈體的產(chǎn)生與CEA的傳感性能相關(guān)，因此對影響Hemin/G-四鏈體產(chǎn)生的因素包括HP的濃度、P1的濃度及反應(yīng)時間進行了優(yōu)化(圖4A)。隨著發(fā)卡探針HP濃度增大，檢測體系熒光強度逐漸減小，在100 nmol/L時達到最低值，因此，最適的HP濃度為100 nmol/L。按照同樣方法進行考察，發(fā)現(xiàn)P1的最適濃度為100 nmol/L(圖4B)。如圖4C所示，隨著酶反應(yīng)時間延長(30～120 min)，熒光強度逐漸降低; 繼續(xù)延長酶反應(yīng)時間(120～180 min)，放大效果增加不明顯?；诖?，選擇最佳的酶輔助反應(yīng)時間為120 min。

圖4 HP用量(A)、 P1用量(B)、 反應(yīng)時間(C)和不同熱處理(90℃)時間(D)對AIE傳感體系熒光響應(yīng)的影響， CEA濃度為200 fmol/LFig.4 Effect of HP dosage (A), P1 dosage (B), incubation time (C) and heat-treatment time at 90℃ (D) on fluorescence signal of TPE-M/L-Cys system toward 200 fmol/L CEA

在反應(yīng)過程中，為了提高酶的活性、減少核酸片段的降解，加入DTT作為強效還原劑。但是，DTT含有自由的巰基，可與TPE-M反應(yīng)，點亮其熒光，干擾CEA的分析檢測。為消除DTT對傳感體系的干擾，對擴增后的溶液進行90℃熱處理，考察了作用時間對熒光強度的影響(圖4D)。未進行熱處理的體系在CEA存在時仍表現(xiàn)出較強的熒光信號，這主要是因為CEA雖可引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng)生成大量Hemin/G-四鏈體，進而消耗L-Cys，阻止其與TPE-M反應(yīng)，但體系中存在的大量DTT可與TPE-M反應(yīng)。隨著熱處理時間延長，體系熒光強度逐漸降低，在10 min達到最低值。這表明90℃熱處理10 min，可高效消除檢測體系中存在的巰基化合物，提高檢測的準確度。

3.5 傳感性能分析

在最佳條件下，考察了本傳感器對CEA的檢測性能。如圖5A所示，在0.1～200 fmol/L范圍內(nèi)，隨著CEA濃度的增加，體系熒光強度逐漸降低。以453 nm處的熒光強度(F453)為縱坐標、CEA濃度的對數(shù)(lgCCEA)為橫坐標，繪制工作曲線(圖5B)，結(jié)果表明，F(xiàn)453與lgCCEA呈良好的線性關(guān)系，線性方程為F453=-128.46 lgCCEA+ 400.69，(R2=0.9965)，檢出限為0.033 fmol/L (S/N=3)。與文獻報道的檢測CEA的方法相比(表2)，本方法靈敏度和檢出限與之相當(dāng)或更優(yōu)。

圖5 (A)不同濃度CEA存在下TPE-M/L-Cys體系的熒光光譜; (B)TPE-M/L-Cys體系的熒光強度與CEA濃度的線性曲線Fig.5 (A) Fluorescent curves of TPE-M/L-Cys system in the presence of different concentrations of CEA; (B) Linear relationship of FL signal versus logarithm of CEA concentration

表2 不同CEA檢測方法性能比較

考察了本傳感器對CEA檢測的選擇性。在同樣條件下，采用200 fmol/L的AFP、CA125與CA199進行了驗證。如圖6A所示，當(dāng)且僅當(dāng)CEA存在時，檢測體系的熒光信號才大幅度降低，而AFP、CA125與CA199并不能引起體系的熒光強度降低, 這表明HP適配體具有特異性識別CEA的能力。將AFP、CA125、CA199與CEA混合后再進行檢測，檢測體系的熒光信號仍很低，其數(shù)值與CEA單獨存在時相當(dāng)，表明AFP、CA125與CA199的存在并不會對CEA的檢測造成干擾，進一步證實本傳感器具有優(yōu)異的選擇性與抗干擾能力。

為了驗證構(gòu)建的AIE傳感器的穩(wěn)定性，采用同樣方法，在20 μmol/L KNO3、Ca(NO3)2、葡萄糖(Glucose)、甘氨酸(Glycine)、谷氨酸(Glutamic acid)和谷胱甘肽(GSH)存在條件下，檢測200 fmol/L CEA(圖6B)。加入這些干擾物并未對檢測體系的熒光信號產(chǎn)生影響，其原因為90℃熱處理可有效去除巰基化合物，表明本研究構(gòu)建的AIE傳感器具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

圖6 (A)不同分析物(200 fmol/L)存在下TPE-M/L-Cys體系的熒光強度; (B)干擾物對TPE-M/L-Cys體系檢測200 fmol/L CEA強度的影響Fig.6 (A) FL intensity of TPE-M/L-Cys system upon the addition of CEA, α-fetoprotein (AFP), CA125, and CA129, and the mixture of these substances, respectively; (B) FL intensity of TPE-M/L-Cys system toward 200 fmol/L CEA in the presence of 200 μmol/L different substances

3.6 實際樣品分析

利用構(gòu)建的AIE傳感平臺進行了血清樣品中CEA的檢測，結(jié)果見表3。在30%稀釋的血清中，5個加標水平下的回收率分別為97%、 103%、 96%、 104%和105%，相對標準偏差<5%，表明本方法可用于實際樣品中CEA的檢測。

表3 血清樣品中CEA的檢測結(jié)果

4 結(jié) 論

基于Hemin/G-四鏈體對L-Cys的催化氧化作用、TPE-M對L-Cys響應(yīng)以及L-Cys與Cys-cys的分子結(jié)構(gòu)差異，結(jié)合目標物引發(fā)的酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)，構(gòu)建了AIE材料介導(dǎo)的熒光生物傳感器，實現(xiàn)了CEA的免標記、高靈敏檢測。目標分子CEA引發(fā)指數(shù)擴增反應(yīng), 產(chǎn)生大量Hemin/G-四鏈體，催化氧化L-Cys， 阻止L-Cys與TPE-M的反應(yīng)，進而引起檢測體系的熒光強度變化，實現(xiàn)對CEA的免標記、高靈敏檢測，檢出限低至0.033 fmol/L。同時，此傳感器具有優(yōu)異的選擇性、穩(wěn)定性與抗干擾能力，可用于血清中CEA的分析檢測。本研究為建立免標記、靈敏的高性能熒光傳感器提供了參考，拓寬了AIE材料的應(yīng)用范圍，在臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。