油用蘿卜籽中黃酮提取工藝優(yōu)化

朱涵彬，李 靚，董麗鑫

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450046)

0 引言

蘿卜是一種普通的蔬菜，在全國(guó)各地均有栽培，蘿卜籽是蘿卜的成熟種子，別名萊菔子、蘿白子和菜頭子等，形狀呈卵圓形或橢圓形，略扁，表面顏色為黃棕色、紅棕色或灰褐色，具有食用價(jià)值和藥用價(jià)值，但并沒(méi)有得到良好的應(yīng)用[1]。隨著對(duì)油料資源的開(kāi)發(fā)，人們逐漸開(kāi)始重視油用蘿卜籽的有效成分研究。近年來(lái)有研究表明，蘿卜籽粕中含有較為豐富的黃酮類(lèi)化合物，黃酮是存在于大多數(shù)植物體內(nèi)的一種天然化合物，含有2-苯基色酮結(jié)構(gòu)[2-4]。黃酮類(lèi)化合物分子式中含有酮式羰基，第1位上的氧原子具堿性，故俗稱(chēng)黃堿素或黃酮。黃酮類(lèi)化合物因具有降壓、降血脂、抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗血栓、抗病變、阻止細(xì)胞衰老、提高機(jī)體免疫力、維護(hù)心血管系統(tǒng)和保肝等藥理功能，具有很好的開(kāi)發(fā)潛質(zhì)，受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視。因此，有必要對(duì)蘿卜籽中的黃酮化合物進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

油用蘿卜籽品名：超級(jí)白美濃；品質(zhì)：一級(jí)；購(gòu)于武漢市蔬菜科學(xué)研究所。蘆丁對(duì)照品購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等提取用的溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，均為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

主要儀器：DGG-9030A型鼓風(fēng)干燥箱(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；HR-08型多功能粉碎機(jī)(上海哈瑞斯電器有限公司)；FA1004T型分析天平(廈門(mén)雄發(fā)儀器儀表有限公司)；VGT-2013QTD型超聲波清洗器(250W，廣東固特超聲股份有限公司)；ROTINA380R型臺(tái)式大容量冷凍離心機(jī)(德祥科技有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程

樣品→干燥→粉碎→稱(chēng)取→浸泡→超聲波輔助提取→離心→稀釋→定容→樣品液→取樣測(cè)定。

1.2.2繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇溶解，并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中稀釋至刻度，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.4 mgmL。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液于25 mL比色管中，加水至10 mL。在6支比色管中分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，振蕩搖勻，放置6 min；再分別加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；最后各加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加蒸餾水至刻度線，定容，振蕩搖勻后，放置15 min。以空白試劑為對(duì)照，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.2.3制備樣品液

將50 g蘿卜籽放入干燥箱中，在100 ℃條件下干燥4 h，然后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)100目篩，待用。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g蘿卜籽粉末，置于250 mL錐形瓶中，按一定的料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，振蕩搖勻，浸泡30 min，在一定溫度下，超聲提取一定時(shí)間后，取出錐形瓶，冷卻至室溫，再倒入離心管中，以8 000 rmin離心后，將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容，即為樣品液[6]。

1.2.4單因素試驗(yàn)

分別以料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，設(shè)置各因素的不同水平，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定試驗(yàn)因素對(duì)蘿卜籽提取液中總黃酮提取率的影響。

(1)料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。

設(shè)定乙醇濃度為70%，超聲溫度為55 ℃，超聲時(shí)間為30 min，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35 gmL的料液比量取相應(yīng)的乙醇溶液于錐形瓶中。

(2)乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。

(3)超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

(4)超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。

1.2.5響應(yīng)面試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原則，合理選擇因素水平，使用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)4因素3水平的試驗(yàn)[7]。

1.2.6測(cè)定總黃酮得率

精密吸取5 mL樣品液，于25 mL比色管中，按1.2.2方法處理測(cè)定，用線性回歸方程測(cè)定1 g樣品中總黃酮的濃度，再用式(1)計(jì)算1 g樣品中總黃酮得率。

w=cnvm

(1)

式中w——總黃酮得率，mgg

c——樣品溶液中黃酮類(lèi)化合物的質(zhì)量濃度，mgmL

n——稀釋倍數(shù)

v——樣品液的體積，mL

m——樣品質(zhì)量，g

2 結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著料液比的增加，蘿卜籽中黃酮類(lèi)化合物的提取量先增加后減少。當(dāng)料液比小于1∶25 gmL時(shí)，黃酮含量隨料液比的增加而增大；當(dāng)料液比為1∶25 gmL時(shí)，黃酮含量最高；當(dāng)料液比大于1∶25 gmL時(shí)，黃酮含量逐漸降低。這可能是因?yàn)樵谝欢弦罕确秶鷥?nèi)，增加料液比有利于增加活性成分與溶劑的接觸機(jī)會(huì)，擴(kuò)大組織體系中的濃度差，活性成分更容易溶解[8]。當(dāng)料液比增加到一定量的時(shí)候，有效成分的溶解達(dá)到了一種動(dòng)態(tài)平衡，乙醇溶液將黃酮基本溶解出來(lái)，提取含量不再增加。如果繼續(xù)增大料液比，可能會(huì)使一些醇溶性物質(zhì)溶解，從而干擾黃酮提取含量的測(cè)定，導(dǎo)致黃酮含量下降，并且造成試劑的浪費(fèi)。因此最佳的料液比為1∶25 gmL。

2.2.2乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖3所示。

從圖3可以看出，在一定乙醇濃度范圍內(nèi)，蘿卜籽中黃酮類(lèi)化合物的含量隨乙醇濃度的增加先升高后降低。當(dāng)乙醇濃度<70%時(shí)，提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加；當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取量最高；當(dāng)乙醇濃度>70%時(shí)，提取量減少。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ娜軇舛确秶鷥?nèi)，溶劑濃度的增加有利于溶劑與原料的充分接觸，使黃酮類(lèi)化合物的含量增加。當(dāng)達(dá)到一定濃度，黃酮的含量達(dá)到最高；再增加溶劑濃度，導(dǎo)致干擾性雜質(zhì)溶出，對(duì)黃酮含量的測(cè)定造成影響。因此乙醇的最佳濃度為70%。

2.2.3超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高黃酮類(lèi)化合物的含量先升高后降低。當(dāng)超聲溫度<55 ℃時(shí)，黃酮含量隨溫度升高而增加；當(dāng)超聲溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，黃酮含量最高；當(dāng)超聲溫度>55 ℃時(shí)，黃酮含量減少。這可能是因?yàn)橐欢囟确秶鷥?nèi)，溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)速率越快，使體系內(nèi)反應(yīng)速率加快，溶液擴(kuò)散、滲透和溶解地較為徹底，黃酮類(lèi)化合物更容易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)入到溶劑中。但是當(dāng)溫度上升到一定程度的時(shí)候，一些黃酮類(lèi)化合物可能會(huì)降解和破壞，從而導(dǎo)致含量下降。因此，最佳超聲溫度為55 ℃。

2.2.4超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮含量先增加后減少。當(dāng)超聲時(shí)間<30 min時(shí)，黃酮含量隨超聲時(shí)間增加而增加；當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，黃酮含量最高；當(dāng)超聲時(shí)間>30 min時(shí)，黃酮含量略有下降。這可能是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)對(duì)黃酮類(lèi)化合物的溶解越有利，但當(dāng)時(shí)間長(zhǎng)到一定程度，再延長(zhǎng)時(shí)間，超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)和振動(dòng)作用，會(huì)導(dǎo)致黃酮化合物的降解，測(cè)定含量偏低。因此，最佳超聲時(shí)間為30 min。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平如表1所示。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2數(shù)據(jù)模型的建立及回歸方程的方差分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合處理后，得到回歸方程為

黃酮總量=15.00+0.24A+0.10B-0.53C-0.35D+0.65AB+0.62AC+0.14AD+0.32BC+0.48BD-0.10CD-1.04A2-2.20B2-0.61C2-0.71D2

(2)

式中A——料液比，gmL

B——乙醇濃度， %

C——超聲溫度， ℃

D——超聲時(shí)間， min

所得的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

根據(jù)表3，模型F=9.30，P<0.000 1，表明二次回歸方程模型極顯著[9]。失擬項(xiàng)F=1.19，P=0.468 9，不顯著，說(shuō)明二次回歸方程擬合度較高，用于計(jì)算結(jié)果是有意義的。

表3中，二次項(xiàng)A2和B2，P<0.001，極顯著；C和D2，P<0.01，高度顯著；AB、C2顯著。通過(guò)響應(yīng)面分析得出對(duì)黃酮提取含量影響的大小順序?yàn)槌暅囟?超聲時(shí)間>料液比>乙醇濃度。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出，料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素之間兩兩相互作用對(duì)黃酮提取含量影響情況，如圖6～11所示。

2.3.3最佳工藝檢驗(yàn)

油用蘿卜籽中總黃酮提取工藝的最佳條件：超聲溫度53 ℃，超聲時(shí)間28 min，料液比為1∶25 gmL，乙醇濃度為70%，此時(shí)提取率最高，蘿卜籽中總黃酮的提取含量為15.15 mgg。

經(jīng)過(guò)3組平行試驗(yàn)，證明應(yīng)用上述最佳提取工藝條件，實(shí)際油用蘿卜籽中總黃酮的平均提取含量為15.18 mgg，與軟件預(yù)測(cè)值接近，證明最佳工藝預(yù)測(cè)值較準(zhǔn)確[10-11]。

3 結(jié)論

通過(guò)分析料液比、乙醇濃度、超聲溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素及兩兩因素間對(duì)總黃酮提取含量的影響，得出各因素對(duì)提取含量影響大小的順序?yàn)槌暅囟?超聲時(shí)間>料液比>乙醇濃度。當(dāng)料液比1∶25 gmL，乙醇濃度70%，超聲溫度53 ℃，超聲時(shí)間28 min時(shí)，提取率最高，此時(shí)總黃酮含量為15.18 mgg，與模型預(yù)測(cè)值15.15 mgg接近，表明此工藝較為可靠，有一定的參考價(jià)值。