高圣風(fēng) 楊開虎 陸大倩 劉愛勤 茍亞峰 孫世偉 王政 孟倩倩

摘 ?要：孢子囊的產(chǎn)生和發(fā)育過程是研究胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）及其病害防控的重要基礎(chǔ)。本研究分析不同誘導(dǎo)條件下胡椒瘟病菌孢子囊的產(chǎn)生情況，并通過光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察孢子囊及其內(nèi)部游動孢子的發(fā)育過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）3種誘導(dǎo)方法均能誘導(dǎo)出大量孢子囊，其中在V8-A平板上光照和抹傷雙重誘導(dǎo)法獲得的孢子囊數(shù)量最多，其次是在V8-A平板上光照誘導(dǎo)法，獲得孢子囊數(shù)量最少的是V8液體光照誘導(dǎo)法，但僅差異最大的2個處理間達(dá)到顯著水平;（2）顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子囊由氣生菌絲頂端逐步膨大形成，初始為近球形逐漸發(fā)育成倒洋梨形，孢子囊成熟后從頂端排出大量游動孢子，偶爾可見孢子囊頂端直接發(fā)育出芽管;（3）共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，首先孢子囊內(nèi)部原生質(zhì)體被膜結(jié)構(gòu)隔裂成大約數(shù)十個獨立小格，然后在每個格子中積累數(shù)倍于細(xì)胞核的DNA，最后每份細(xì)胞核DNA發(fā)育成一個游動孢子。本研究從微觀角度揭示P. capsici孢子囊發(fā)育外觀及內(nèi)部的形態(tài)特征，為胡椒瘟病菌后續(xù)致病機(jī)制研究和胡椒瘟病田間防控提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：胡椒瘟病;辣椒疫霉;孢子囊誘導(dǎo);發(fā)育過程

中圖分類號：S432.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Sporangium is an important basis for the Phytophthora foot rot disease control and the pathogen （Phytophthora capsici） research in black pepper， but the sporangium-inducing methods and the micro development processes have not been reported yet. Three sporangium-inducing methods were tested and the sporangia development processes were observed by light microscope and laser confocal microscope. Abundant sporangia could be detected by all the three methods. The most sporangia were obtained by the method of lighting and glass rod-plastering induction on V8-A plates， followed by the lighting induction on V8-A plates and lighting induction in V8 liquid. Under light microscope， sporangia initially formed at the top of the hypha with the shape of small sphere， and gradually formed into an inverted pear shape. When matured， the sporangia released a large number of zoospores from an apical pore. Interestingly， a few sporangia germinated directly and formed a germ tube. Under laser confocal microscope， the protoplast of a sporangium was separated into dozens of small cells by membrane structure at first， and then multiple nuclear DNA was accumulated in each cell， and finally the multinuclear cell developed into several mononuclear zoospores. The study revealed the morphological characteristics of the P. capsici sporangium development progress would provide sporangium-inducing methods for further pathogenic mechanisms research and field disease management.

Keywords： black pepper phytophthora foot rot; Phytophthora capsici; sporangia induction; development process

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.021

胡椒（Piper nigrum Linn.）是一種經(jīng)濟(jì)價值極高的食品香料作物，是海南省第三大經(jīng)濟(jì)作物。胡椒瘟病具有極強(qiáng)的毀滅性和傳播性，在20世紀(jì)70年代曾導(dǎo)致中國胡椒種植面積縮減20%，其病原物是辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）[1-2]。2009—2010年對我國胡椒主產(chǎn)區(qū)海南省胡椒病害發(fā)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病在海南省11個胡椒主要種植市（縣）均普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重[3-4]，而且最近幾年胡椒瘟病呈現(xiàn)蔓延加重趨勢，是影響胡椒產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的重要瓶頸之一。

孢子囊和游動孢子是P. capsici的再侵染源，可以通過氣流和水流快速傳播，造成病害蔓延流行。孢子囊的產(chǎn)生不僅是P. capsici在田間發(fā)生流行的關(guān)鍵前提，也是實驗室科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，尤其在侵染致病、遺傳操作等相關(guān)研究上至關(guān)重要。在國外，P. capsici的孢子囊誘導(dǎo)技術(shù)報道較多，主要是在V8蔬菜汁培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)后光照誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生[5-7]。在國內(nèi)，除了V8蔬菜汁培養(yǎng)基，黑麥培養(yǎng)基、大豆培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基等也被用于誘導(dǎo)P. capsici孢子囊[8-11]，其誘導(dǎo)條件也不僅限于單獨光照，蘭成忠等[12]在光照誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上提出了抹傷誘導(dǎo);但是未見研究胡椒瘟病病原菌孢子囊誘導(dǎo)技術(shù)的相關(guān)報道。受限于孢子囊誘導(dǎo)技術(shù)，目前胡椒瘟病的致病性接種也主要采用菌絲塊傷口接種方法[13-14]，尚未使用與P. capsici自然侵染一致的游動孢子接種法[6]。國內(nèi)外通過光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡等手段研究發(fā)現(xiàn)P. capsici的孢子囊形態(tài)主要是倒洋梨形，也常見卵形、長卵形、球形、不規(guī)則形等性狀[15-18]，但是對其孢子囊發(fā)育及其內(nèi)部游動孢子發(fā)育過程尚未見報道。

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，分析不同誘導(dǎo)條件下胡椒瘟病菌孢子囊的產(chǎn)生情況，并通過光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察孢子囊和游動孢子的發(fā)育過程，從微觀角度揭示胡椒瘟病菌的形態(tài)特征，為胡椒瘟病致病機(jī)制等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?胡椒瘟病菌由本研究室從胡椒病株中分離純化得到，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）試管斜面培養(yǎng)基中室溫保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基 ?胡椒瘟病菌保藏及活化使用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，切成小塊，在800 mL去離子水中煮沸15 min，用雙層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖和瓊脂粉各20 g，用去離子水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min[2]。

胡椒瘟病菌孢子囊誘導(dǎo)培養(yǎng)基：（1）10% V8蔬菜汁（V8）培養(yǎng)基，離心后的V8蔬菜汁100 mL， CaCO3 1g，用去離子水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min[7];（2）10% V8蔬菜汁瓊脂（V8-A）培養(yǎng)基，配制方法與V8培養(yǎng)基基本相同，僅在滅菌前添加瓊脂粉20 g/L[7]。

1.1.3 ?熒光染料 ?激光掃描共聚焦顯微觀察使用2種熒光染料：（1）4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI），能夠與雙鏈DNA結(jié)合，在波長330～405 nm的紫外光下激發(fā)出波長461 nm的藍(lán)光;（2）苯乙烯染料（N-（3- Triethylammoniumpropyl）-4-（6-（4-（Diethylamino） phenyl） hexatrienyl） Pyridinium Dibromide， FM?4- 64FX），能夠結(jié)合細(xì)胞質(zhì)膜，在波長510～570 nm的綠光下激發(fā)出波長734 nm的紅光，2種染料均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?胡椒瘟病菌孢子囊誘導(dǎo) ?從保藏的試管斜面中挑取少量菌種轉(zhuǎn)接入PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，再次轉(zhuǎn)接入新的PDA平板中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，作為以下孢子囊誘導(dǎo)方法的出發(fā)菌種。

V8液體培養(yǎng)光照誘導(dǎo)：將胡椒瘟病菌接種在V8-A平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，切成直徑約1 cm的菌絲塊浸入V8液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下暗培養(yǎng)7 d后，挑取菌叢用無菌去離子水清洗后浸入無菌去離子水中，在28 ℃條件下光照培養(yǎng)，24 h后開始取樣，每隔12 h取樣1次，做成臨時裝片，用光學(xué)顯微鏡檢測孢子囊數(shù)量。

V8-A平板培養(yǎng)光照誘導(dǎo)：將胡椒瘟病菌接種在V8-A平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，然后在28 ℃條件下光照培養(yǎng)，24 h后開始取樣，每隔12 h取樣1次，用光學(xué)顯微鏡檢測孢子囊數(shù)量。

V8-A平板培養(yǎng)光照和抹傷雙重誘導(dǎo)：將胡椒瘟病菌接種在V8-A平板上，置于28 ℃光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用無菌玻璃棒涂抹菌絲后再次置于28 ℃光照生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后開始取樣，每隔12 h取樣1次，用光學(xué)顯微鏡檢測孢子囊數(shù)量。

1.2.2 ?孢子囊光學(xué)顯微鏡觀察 ?孢子囊數(shù)量分析：在載玻片上滴加無菌去離子水15 μL，挑取少量菌絲平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片后置于奧林巴斯IX71倒置式顯微鏡載物臺上，用200倍視野進(jìn)行觀察。每個處理設(shè)置3個樣本重復(fù)，每個樣本制作5個臨時裝片，鏡檢時選取菌絲分布均勻一致的視野利用cellSens Dimension軟件統(tǒng)計單位面積（mm2）中的孢子囊數(shù)量。

孢子囊發(fā)育過程觀察：在Φ15mm玻底培養(yǎng)皿中加入無菌去離子水50 μL，挑取少量菌絲放入培養(yǎng)皿中使菌絲平鋪于玻底，四周放置吸足無菌水的脫脂棉保濕，蓋上蓋子后置于奧林巴斯IX71倒置式顯微鏡載物臺上，用400倍視野利用cellSens Dimension軟件進(jìn)行觀察并采集圖像，每20 min采集一次，直至孢子囊成熟或游動孢子釋放。

1.2.3 ?孢子囊染色及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 ?細(xì)胞核酸的染色及其觀察：DAPI染料用無菌去離子水配制成終濃度為10 mmol/L的母液，避光保存于-20 ℃冰箱中。將DAPI母液和無菌去離子水按照1∶5000體積稀釋配置成染色液，染色液現(xiàn)配現(xiàn)用。挑取少量待檢測菌絲浸入染色液中5 min，在無菌水中清洗3次后制成臨時裝片，置于Olympus Flv10智能激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺上。選取波長330～405 nm的激發(fā)光進(jìn)行顯微觀察，使用Olympus Fluoview V4.2軟件采集圖像。

細(xì)胞膜染色及其觀察：FM?4-64FX染料用無菌去離子水配制成終濃度為164 μmol/L的母液，避光保存于-20 ℃冰箱中。將FM?4-64FX母液和無菌去離子水按照1∶10體積稀釋配置成染色液，染色液現(xiàn)配現(xiàn)用。挑取少量待檢測菌絲浸入染色液中1 min，在無菌水中清洗3次后制成臨時裝片，置于Olympus Flv10智能激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺上。選取波長510～570 nm的激發(fā)光進(jìn)行顯微觀察，使用Olympus Fluoview V4.2軟件采集圖像。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0（SPSS Inc.， Chicago， IL， USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析（one- way ANOVA），費雪最小顯著差異檢驗（Fishers least-significant difference test， LSD）（P<0.05）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?孢子囊誘導(dǎo)效果分析

分別采用3種不同的方法開展胡椒瘟病菌孢子囊誘導(dǎo)試驗。顯微鏡下檢測發(fā)現(xiàn)，3種誘導(dǎo)方法均能將胡椒瘟病菌誘導(dǎo)出大量孢子囊;其中V8-A平板培養(yǎng)光照和抹傷雙重誘導(dǎo)方法（方法3）獲得的孢子囊數(shù)量最多，其次是V8-A平板培養(yǎng)光照誘導(dǎo)方法（方法2）和V8液體培養(yǎng)光照誘導(dǎo)方法（方法1），但是僅方法1和方法3之間有顯著性差異（P<0.05），其他處理間差異均不顯著（表1）。

2.2 ?孢子囊形態(tài)及其發(fā)育過程觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察孢子囊的發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，孢子囊產(chǎn)生于其菌絲頂端，初始為圓球狀并逐漸膨大發(fā)育成倒洋梨形的孢子囊（圖1A1～A4）;偶爾可見一些孢子囊頂端再次發(fā)生形態(tài)變化，在排孢孔處向外延伸逐漸發(fā)育成形狀類似菌絲的芽管（圖1B1～B4）;孢子囊發(fā)育成熟后從頂端排孢孔中排出游動孢子，游動孢子數(shù)量達(dá)上百個甚至數(shù)百個，剛釋放的游動孢子初始擁擠成團(tuán)，然后逐漸向四周分散（圖1C1～C4）。

經(jīng)過DAPI和FM?4-64FX 2種熒光染料染色后，在智能激光掃描共聚焦顯微鏡下可以看到細(xì)胞核和細(xì)胞膜分別被染成藍(lán)色和紅色（圖2）。孢子囊形成初期，其內(nèi)部原生質(zhì)體被膜結(jié)構(gòu)隔裂成大約數(shù)十個彼此獨立的小格，小格呈蜂巢狀排列（圖2A1～A4）;然后，在格子中逐漸累積大量DNA，形成一個體積數(shù)倍于細(xì)胞核的DNA團(tuán)（圖2B1～B4，C1～C4）;小格內(nèi)DNA團(tuán)分散并發(fā)育成單核的游動孢子，每個孢子囊內(nèi)游動孢子數(shù)量達(dá)上百個甚至數(shù)百個（圖2D1～D4）。

3 ?討論

眾所周知，常規(guī)培養(yǎng)條件難以獲得大量的P. capsici孢子囊。近年來，P. capsici孢子囊誘導(dǎo)技術(shù)日漸成熟，已通過文獻(xiàn)報道或者以專利形式公布了各種方法[8-12]。但是國內(nèi)外研究的P. capsici菌株主要來源于溫帶的辣椒、茄子等作物，與來源于熱帶的胡椒瘟病菌在遺傳學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹上歸屬不同的分類亞群[19]。本研究將辣椒疫霉孢子囊誘導(dǎo)方式簡單歸為3類，即液體培養(yǎng)基中光照誘導(dǎo)、固體平板上光照誘導(dǎo)和固體平板上光照、抹傷雙重誘導(dǎo)（表1）。研究發(fā)現(xiàn)使用V8或V8-A培養(yǎng)基培養(yǎng)時，3種誘導(dǎo)方法均可以獲得大量的孢子囊，說明來源于熱帶的胡椒瘟病菌與溫帶的P. capsici在孢子囊誘導(dǎo)條件上差異不大。3種方法誘導(dǎo)的孢子囊數(shù)量分別為87.47、101.72和122.00個/mm2，總體差距不大，可約略視為同一水平;結(jié)合操作難易程度和易污染程度，建議開展遺傳操作等研究時采用不易污染的液體培養(yǎng)基光照誘導(dǎo)方法，開展致病性接種等研究可采用易操作的其他2種方法。此外，在顯微觀察過程中細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，細(xì)胞膜被FM?4-64FX染成紅色;A1～4：孢子囊內(nèi)部被細(xì)胞膜分成多個小格;B1～4和C1～4：孢子囊小格中出現(xiàn)聚集的細(xì)胞核;D1～4：聚集的細(xì)胞核發(fā)育成眾多的游動孢子。

發(fā)現(xiàn)，同一個玻片樣本中的孢子囊發(fā)育進(jìn)程并不完全一致，會出現(xiàn)不同發(fā)育階段的孢子囊混雜的現(xiàn)象（尚未發(fā)表）;結(jié)合多次鏡檢結(jié)果，初步認(rèn)為這3種方法中雙重誘導(dǎo)法的孢子囊發(fā)育進(jìn)程最整齊，但該結(jié)果還需要更多統(tǒng)計數(shù)據(jù)的支撐。

光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)胡椒瘟病菌的孢子囊形態(tài)主要是倒洋梨形，少數(shù)為長圓形、不規(guī)則形等（圖1），與前人報道結(jié)果一致[15-17]，但張開明等[18]報道的多數(shù)是舟型、少數(shù)為梨形或不規(guī)則形。本研究觀察發(fā)現(xiàn)極少量的胡椒瘟病菌可以在孢子囊頂端發(fā)育出菌絲狀結(jié)構(gòu)，在其他P. capsici菌株上尚未發(fā)現(xiàn)類似報道;但是在同屬的致病疫霉（P. infestans）、德雷疫霉（P. drechsleri）中均有孢子囊直接萌發(fā)芽管的報道[20-21]，因此本研究將該菌絲狀結(jié)構(gòu)暫定為芽管。但是，該結(jié)構(gòu)是否像孢子萌發(fā)的芽管一樣可以直接侵染植株，還需要更加深入的研究。

通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病菌孢子囊內(nèi)部被膜結(jié)構(gòu)分隔成數(shù)十個小格，然后在格子中累積成數(shù)倍于細(xì)胞核的DNA團(tuán)，最后DNA團(tuán)分散并發(fā)育成眾多游動孢子（圖2）。該結(jié)果在P. capsici中尚未見類似報道。陶愷報道的大豆疫霉（P. sojae）孢子囊內(nèi)部同樣是先由細(xì)胞膜將原生質(zhì)體分隔成數(shù)十個彼此獨立空間;而不同的是，每個獨立空間只有一個細(xì)胞核，發(fā)育成單個游動孢子[22]。通過反復(fù)觀察胡椒瘟病菌的孢子囊及其游動孢子的釋放過程，發(fā)現(xiàn)每個孢子囊至少能釋放出約200個游動孢子，遠(yuǎn)大于其膜結(jié)構(gòu)分隔出的獨立空間個數(shù)，認(rèn)為胡椒瘟病菌的游動孢子發(fā)育過程與大豆疫霉可能存在差異（尚未發(fā)表）。但是，是否所有P. capsici的游動孢子發(fā)育過程均與胡椒瘟病菌一致，還需要后續(xù)更多的研究。

對于胡椒瘟病菌孢子囊發(fā)育的時間周期，本研究已做一些探索。通過顯微鏡對視野中的特定菌絲進(jìn)行長時間定位監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，從菌絲末端膨大到發(fā)育成一個倒洋梨形的孢子囊大約需要8～12 h;但是完整監(jiān)測一個孢子囊的發(fā)育全程難度極大，成功的樣本數(shù)量不多，該結(jié)果還需要更多數(shù)據(jù)支撐。另外，監(jiān)測到大量的孢子囊釋放過程，發(fā)現(xiàn)該過程較為短暫，從游動孢子開始釋放到孢子囊放空僅需要大約15～30 s;但是該過程受環(huán)境溫度變化影響較大，迅速降溫可將該過程縮短至10 s以內(nèi)（尚未發(fā)表）。對于顯微鏡觀察結(jié)果，值得注意的是，顯微鏡觀測環(huán)境與孢子囊誘導(dǎo)環(huán)境、自然環(huán)境之間的差異可能影響觀察結(jié)果。但是生動具體的微觀觀察結(jié)果對認(rèn)識微生物形態(tài)變化都具有重要的指導(dǎo)意義。

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