黃迪 黃延勝 王靜蕾 董謝薇

基于分子標(biāo)記的選擇育種和轉(zhuǎn)基因育種是分子水稻育種的主要內(nèi)容，基因編輯技術(shù)的發(fā)展賦予分子水稻育種新的生命力。本文從產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性等方面解釋了分子刺激育種的生物學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)分子刺激育種的研究成果和基因組加工技術(shù)在分子刺激育種中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

雜交水稻種植為確保中國(guó)的糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)，但是隨著時(shí)間的推移，隨著多樣化市場(chǎng)的需求，難以有效地發(fā)揮其發(fā)展?jié)摿?，環(huán)境變化也日益復(fù)雜。水稻的分子繁殖基于分子生物學(xué)和經(jīng)典遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)。通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和生物信息學(xué)來(lái)實(shí)施新育種，克服了水稻育種周期長(zhǎng)、效率低的弊端，已成為現(xiàn)代水稻育種發(fā)展的主要趨勢(shì)，是我國(guó)糧食安全的重要技術(shù)保障。此外，近年來(lái)基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展已經(jīng)證明了水稻分子復(fù)制的廣闊潛力。以下是有關(guān)水稻功能基因的研究成果，分子基因領(lǐng)域的最新進(jìn)展以及在分子培養(yǎng)中開(kāi)發(fā)基因編輯技術(shù)的可能性。

1 多重PCR方法

為了提高標(biāo)記物的分類效率，當(dāng)同時(shí)檢查與兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)特征相關(guān)的多個(gè)不同分子標(biāo)記物時(shí)，如果這些分子標(biāo)記物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有不同的長(zhǎng)度，那么在同一條件下，一對(duì)以上的引物可以同時(shí)相互作用PCR條件，這稱為多重?cái)U(kuò)增。使用這種方法時(shí)，在設(shè)計(jì)或選擇點(diǎn)火材料時(shí)，應(yīng)考慮刺的改裝溫度是否相同，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的大小沒(méi)有重疊。研究表明，多次擴(kuò)增使用與單個(gè)引物相同數(shù)量的Taq酶。這大大降低了檢查成本和掃描時(shí)間。

2 用相斥相分子標(biāo)記進(jìn)行育種選擇

所謂交替分子相標(biāo)記是指與排斥的目標(biāo)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，即具有分子標(biāo)記，并且植物不顯示目標(biāo)性狀;沒(méi)有分子標(biāo)記，則植物顯示目標(biāo)性狀。這些選項(xiàng)對(duì)于諸如RAPD標(biāo)簽的主要標(biāo)簽特別有效。

Haley等（1994）發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與bc-3隱性耐藥基因的普通藥丸花葉病抗性病毒相關(guān)的RAPD標(biāo)記。其中，標(biāo)記1和bc-3的距離為1.9厘米;標(biāo)記2與bc-3的距離為7.1厘米。對(duì)純合性，雜合抗性菌株和標(biāo)記為1%的特異純合菌株的抗性分別為26.3%，得分為2的特定結(jié)局分別為81.8%，18.2%。當(dāng)同時(shí)使用兩個(gè)標(biāo)簽時(shí)，這等效于可待因符號(hào)。選擇效果與單獨(dú)標(biāo)記2的選擇效果相同。通常認(rèn)為，在選擇早期育種時(shí)，相互排斥的RAPD標(biāo)簽的使用與編碼RFLP標(biāo)簽具有類似的選擇效果。

3 克服連鎖累贅

回交育種是一種常見(jiàn)的農(nóng)作物生長(zhǎng)方法，但是回交育種的長(zhǎng)期問(wèn)題是在回交過(guò)程中，靶基因與附近的非靶基因相關(guān)，從而一起導(dǎo)入受體稱為連鎖累贅（Linkage drag）。

與附加選擇的靶性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記的使用可以顯著降低結(jié)合的負(fù)擔(dān)。例如，在約150個(gè)重疊的后代中，至少有一種植物有95%的機(jī)會(huì)在感興趣的基因的左或右1厘米范圍內(nèi)交換，使用RFLP標(biāo)簽準(zhǔn)確識(shí)別這些個(gè)體;在300株植物中，有95種可能它們中的30%必須在指定基因的另一側(cè)的1厘米范圍內(nèi)交換，從而產(chǎn)生感興趣基因的大于2厘米的部分。通過(guò)僅在兩代中選擇RFLP即可獲得此結(jié)果;傳統(tǒng)方法可能平均需要100代。隨著分子標(biāo)記圖變得更密集，重組個(gè)體的選擇效率將提高。因此，建立高密度分子遺傳圖譜對(duì)于加速作物種植是必要的。

4 降低MAS育種的成本

對(duì)于MAS，第一步樣品DNA樣品提取。體積在PCR相互作用期間減小體積。例如，在反應(yīng)過(guò)程中，體積從25μL減小到15μL甚至10μL。

瓊脂糖（Agrose）凝膠：實(shí)驗(yàn)表明，相同的Agrose凝膠可多次加載樣品，而不會(huì)引起樣品之間的干擾。

擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通常用EB染色，通過(guò)LTV觀察，并使用寶麗來(lái)膠片相機(jī)系統(tǒng)。通過(guò)這種監(jiān)視方法，不僅刺激了致癌物，而且紫外線對(duì)眼睛造成了很大的損害，并且照相機(jī)系統(tǒng)的成本也很高。通過(guò)修飾染色系統(tǒng)，可在可見(jiàn)光下直接檢測(cè)到的瓊脂糖凝膠用亞甲基藍(lán)染色。即使只有一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，也不需要電泳，只需要在反應(yīng)管中加入EB，就可以根據(jù)紫外線燈下的反應(yīng)直接確定目標(biāo)基因型，這在粘貼的幫助下大大降低了選擇成本這對(duì)于大規(guī)模育種非常有用。

隨著環(huán)境變化的不斷增長(zhǎng)和人類需求的多樣化，中國(guó)稻米種植的重點(diǎn)不僅限于生產(chǎn)單一產(chǎn)品。在新時(shí)代的新形勢(shì)下，研究人員還將關(guān)注新概念，例如水稻、水稻品種，對(duì)環(huán)境的嚴(yán)格適應(yīng)以及減少資源的使用，包括增強(qiáng)谷物中的微量元素，發(fā)展無(wú)菌性和抵抗壓力。水稻品種以及實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好和環(huán)境可持續(xù)的水稻生產(chǎn)對(duì)分子刺激育種提出了更高的要求。不僅需要不斷了解水稻的重要農(nóng)業(yè)特性以及與多發(fā)性硬化相關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，還需要改進(jìn)有關(guān)分子育種的現(xiàn)有遺傳資源信息系統(tǒng)，并將基于分子標(biāo)記的育種與分子水稻設(shè)計(jì)相結(jié)合，以培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆，異質(zhì)性疾病和具有水稻新品種的理想植物。近年來(lái)，TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)代表的基因組位點(diǎn)的編輯技術(shù)發(fā)展迅速，并已成功地用于編輯現(xiàn)場(chǎng)水稻基因。未來(lái)的遺傳圖譜和衍生技術(shù)，再加上轉(zhuǎn)基因水稻技術(shù)和分子標(biāo)記輔助技術(shù)，可以加速水稻和分子培養(yǎng)的功能基因組研究，將水稻從傳統(tǒng)育種轉(zhuǎn)變?yōu)橛行Ф_的分子水稻，旨在為設(shè)計(jì)育種注入新的活力。