劉文徽， 王昌正， 馬金霞， 邱海霞， 陸云龍， 王剛石， 萬 軍， 吳本儼， 徐世平

1.解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心消化科 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100853；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心激光科；3.解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院病理科

缺血性結(jié)腸炎(ischemic colitis，IC)是指各種原因?qū)е陆Y(jié)腸供血不足而引發(fā)的腸道缺血性損傷，是最常見的腸道血管性疾病，是老年人下消化道出血最常見原因之一[1]，輕者能自行緩解，重者引發(fā)腸壞死、化膿性腹膜炎甚至危及生命。我們前期對79例住院診治的IC患者病歷資料分析顯示，合并潰瘍的IC患者住院時間更長[2]。目前尚無已知藥物能促進缺血腸黏膜損傷的修復(fù)。聚普瑞鋅(Polaprezinc，PZ)是第一個含鋅元素的黏膜保護劑，由鋅和L-肌鈦組成的螯合物，具有黏膜保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、維持細胞穩(wěn)定的作用，可促進肉芽組織再生及胃潰瘍的愈合。本研究擬探索PZ對IC大鼠腸黏膜損傷的修復(fù)作用及可能機制，以期對臨床上IC的防治提供有益選擇。

1 材料與方法

1.1 動物Sprague-Dawley(SD)大鼠購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.2 藥品與試劑PZ原料藥粉末購自博大偉業(yè)制藥有限公司。將PZ粉末溶于蒸餾水中,配制成3 000 mg/L藥物備用。喜泊芬(5 mg/ml)購自重慶市華鼎現(xiàn)代生物制藥有限責(zé)任公司。NF-κB p50抗體檢測試劑盒和HSP70抗體檢測試劑盒均購自SANTA CRUZ Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物：雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±10)g，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度(20～24 ℃)和濕度，及12 h明暗周期交替的標(biāo)準(zhǔn)動物實驗室，自由飲食，并于動物適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.3.2 實驗分組：40只大鼠隨機分為3組：實驗組(開腹+激光照射+PZ治療)24只、對照組(開腹+激光照射)12只、空白組4只。實驗組大鼠造模后每天給予3 000 mg/L PZ 3 ml，正常進食水。對照組造模后和空白組均自由飲食水。

1.3.3 光化學(xué)法建立大鼠模型：參照本實驗室2007年改建并驗證的光化學(xué)法建立IC大鼠模型。即使用倍頻半導(dǎo)體激光器(波長532 nm，清華大學(xué)光電工程系研制)發(fā)射的激光照射制成IC模型。SD大鼠用質(zhì)量濃度為100 g/L的水合氯醛按3 ml/kg劑量腹腔注射麻醉后，開腹找到結(jié)腸，按5 mg/kg劑量由股靜脈注射喜泊芬，注射后5 min用激光照射遠端結(jié)腸系膜側(cè)的漿膜面，對周圍腸管做好防激光保護。光斑直徑為2.34 cm，激光輸出功率550 mW，照射5 min后，硫酸慶大霉素4萬單位沖洗腹腔，關(guān)腹，待大鼠麻醉清醒后送入潔凈室繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本取材所有大鼠于術(shù)后第5天處死，處死前24 h禁食不禁水。取照射系膜對應(yīng)結(jié)腸組織，立即平鋪于預(yù)先置于冰上的玻璃平皿上，肉眼觀察黏膜色澤、有無黏膜損傷、范圍、周圍黏膜情況并拍照。然后放入4%多聚甲醛中固定保存，石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)下觀察腸黏膜病理學(xué)結(jié)果，并采用雙盲法進行Chiu評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常腸黏膜；1分：絨毛頂端上皮下間隙擴大，伴毛細血管充血；2分：上皮下間隙進一步擴大，伴上皮層與固有層中度分離；3分：大量上皮層從絨毛兩側(cè)分離，部分絨毛頂端破壞；4分：絨毛破壞，擴張的毛細血管暴露，固有層細胞增多；5分：固有層破壞，伴出血和潰瘍。

1.5 免疫組化方法檢測各組大鼠結(jié)腸黏膜組織中HSP70和NF-κB p50的表達將標(biāo)本常規(guī)制成石蠟切片。PBS(pH=7.4)沖洗3 min×3次，熱修復(fù)2 min，滴加3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性。PBS沖洗3 min×3次，滴加稀釋好的一抗(NF-κB p50稀釋濃度1∶50；HSP70稀釋濃度1∶300)，4 ℃過夜。PBS沖洗3 min×3次，滴加即用型Super Polymer試劑，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3 min×3次，滴加新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min，自來水沖洗終止染色反應(yīng)。蘇木素輕度復(fù)染，水洗泛藍。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 半定量方法分析HSP70和NF-κB p50的表達

由2名高年資病理科住院醫(yī)師在雙盲情況下分析HSP70的免疫組化結(jié)果。隨機選擇10個視野。按陽性細胞在高倍鏡下所占的比例分級，1級染色范圍≤25%，2級染色范圍>25%且≤75%，3級染色范圍>75%。同時依據(jù)切片中細胞染色強度進行分級，1級無染色，2級淡染，3級深染。每個標(biāo)本的2個分級相乘為最終得分，<3為陰性，≥3為陽性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(兩組比較采用卡方分割法)，等級資料采用Kruskal-Wallis檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠的一般表現(xiàn)開腹手術(shù)并激光照射后全部大鼠均出現(xiàn)厭食、懶動、毛發(fā)卷曲無光澤等表現(xiàn),并有排便次數(shù)增多以及稀便等情況。實驗組24只大鼠，5只術(shù)后第1天出現(xiàn)便中帶少許鮮血，第3天無肉眼可見血絲。對照組12只大鼠，4只術(shù)后第1天便中帶少許鮮血，至第5天實驗結(jié)束前仍有3只便中帶血絲?？瞻捉M大鼠未見便中帶血情況。

2.2 結(jié)腸黏膜大體表現(xiàn)實驗組24只大鼠，其中4只(16.67%)結(jié)腸黏膜有肉眼可見損傷。對照組12只大鼠，其中7只(58.33%)有肉眼可見黏膜損傷，兩組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.545,P=0.011)?？瞻捉M未見肉眼可見的黏膜損傷(見圖1～2)。

2.3 結(jié)腸黏膜鏡下及病理表現(xiàn)對照組大鼠部分腸黏膜表面上皮及固有腺體結(jié)構(gòu)消失，可見纖維組織增生伴淋巴細胞、漿細胞浸潤(見圖3)。實驗組大鼠腸黏膜表面上皮及固有腺體排列較規(guī)則，間質(zhì)局灶見淋巴細胞、漿細胞浸潤。實驗組大鼠結(jié)腸黏膜炎癥程度較對照組輕，實驗組重度炎癥占17.67%(4/24)，對照組重度炎癥占75.0%(9/12)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組有12.5%(3/24)的大鼠黏膜糜爛，顯著低于對照組的50.0%(6/12)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組有17.67%(4/24)的大鼠淋巴細胞浸潤，顯著低于對照組的75.0%(9/12)，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組有45.83%(11/24)的大鼠黏膜下層水腫，低于對照組的66.67%(8/12)，但兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)；對照組結(jié)腸黏膜下瘀血2例，實驗組未見結(jié)腸黏膜下瘀血。

圖1 激光照射大鼠結(jié)腸系膜側(cè)漿膜面；圖2 對照組黏膜充血、糜爛，實驗組黏膜愈合好;圖3 大鼠結(jié)腸黏膜病理圖片(HE染色，放大200倍) A：對照組：大鼠腸黏膜糜爛；B：實驗組：大鼠腸黏膜輕度炎癥

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織鏡下觀察指標(biāo)比較[例數(shù)(%)]

2.4 大鼠結(jié)腸黏膜組織損傷程度分析實驗組結(jié)腸黏膜損傷程度分布以0分和1分為主，對照組則以2～4分為主(見表2)。實驗組腸損傷Chiu評分(1.125±1.262)分顯著低于對照組(2.750±1.138)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。

2.5 大鼠結(jié)腸組織HSP70和NF-κB p50表達情況分析實驗組大鼠結(jié)腸黏膜HSP70表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB p50表達顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖4～5)。

表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織損傷程度分布Tab 2 The degree of colonic mucosal tissue injurydistributed in each group

表3 各組大鼠結(jié)腸組織HSP70 和NF-κB p50表達情況比較Tab 3 Comparison of HSP70 and NF-κB p50 expressions in colon tissues of rats in each group

注：A：實驗組；B：對照組。圖4 大鼠結(jié)腸黏膜HSP70表達(放大200倍);圖5 大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB p50表達(放大200倍)Fig 4 Expression of HSP70 in colonic mucosa; Fig 5 Expression of NF-κB p50 in colonic mucosa

3 討論

IC是最常見的腸道缺血性疾病。有研究報道[3-5],我國90%的IC發(fā)生在60歲以上的老年人，常伴有高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥、心律失常、動脈粥樣硬化等基礎(chǔ)疾病，而且對癥狀反應(yīng)不敏感，IC又有癥狀重、體征輕的特點，部分患者可能發(fā)展成重型伴發(fā)腸壞死等嚴重并發(fā)癥甚至死亡，嚴重威脅老年人群的身體健康。國外學(xué)者曾應(yīng)用不同的方法建立了一些IC動物模型，如使用套圈來制造腸梗阻并結(jié)扎部分血管來造模[6-7]、一過性血管夾閉法造模[8]。但在后來的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，大部分的IC患者并未發(fā)現(xiàn)腸道大血管病變的證據(jù)，更多的是腸道微循環(huán)血流的受損。而光動力療法恰是在受激光照射的小血管內(nèi)形成血栓，符合大部分IC發(fā)病機制。早在2006年，我們研究團隊用光動力療法成功制成大鼠IC模型，并在此基礎(chǔ)上展開一系列實驗研究[9]。

PZ作為有效的抗?jié)兯幬镌谌毡九R床已經(jīng)應(yīng)用20余年，它由23%鋅和77% L-肌鈦鰲合而成，其藥效主要歸因于鋅離子。鋅是身體必需微量元素之一，在不同生物系統(tǒng)和生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。如治愈創(chuàng)傷、促進細胞形成生長和代謝、穩(wěn)定細胞膜、維護正常糖代謝和脂代謝，同時也是DNA和RNA聚合酶依賴的元素，以及維持正常的酒精代謝，鋅元素通過上述功能影響細胞增殖和蛋白質(zhì)合成。PZ的黏膜保護作用機制包括刺激黏液生成、抗氧化活性、膜穩(wěn)定作用及誘導(dǎo)HSP70等。

2007年發(fā)表在Gut上的一篇文章[10]顯示，PZ能促進細胞遷移和增殖，保護吲哚美辛造成的大鼠胃損傷及小鼠小腸損傷；Watari等[11]研究選用因心腦血管疾病服用小劑量阿司匹林的患者為研究對象，服用PZ前后應(yīng)用膠囊內(nèi)鏡進行小腸病變評估，結(jié)果提示PZ能減輕低劑量阿司匹林導(dǎo)致的小腸黏膜損傷；Itagaki等[12]對28例活動性潰瘍性結(jié)腸炎患者研究顯示，應(yīng)用PZ直腸內(nèi)給藥，PZ灌腸組的直腸、乙狀結(jié)腸及降結(jié)腸的炎癥內(nèi)鏡評分較基線水平顯著改善，提示PZ能有效促進活動性潰瘍性結(jié)腸炎的黏膜愈合；國內(nèi)錢家鳴教授團隊研究[13]顯示，PZ保護乙醇所致大鼠胃黏膜損傷。本研究顯示，大鼠造模后，治療組結(jié)腸黏膜肉眼可見的損傷數(shù)目顯著低于對照組；顯微鏡下觀察，治療組結(jié)腸黏膜重度炎癥、糜爛及淋巴細胞浸潤均顯著低于對照組；治療組腸黏膜損傷評分顯著更低。提示PZ有效促進了結(jié)腸黏膜損傷的修復(fù)。

Odashima等[14]報道，大鼠直腸內(nèi)給予PZ后應(yīng)用5%乙酸灌腸，24 h后評估發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜損傷受到保護，結(jié)腸黏膜HSP72的表達升高，而NF-κB的活性受到抑制。在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎模型中，PZ直腸內(nèi)給藥，抑制了鈣調(diào)磷酸酶活化及白介素2等促炎細胞因子的表達，加速結(jié)腸炎癥恢復(fù)[15]。

HSP70是熱休克蛋白家族中主要成員之一，在胃黏膜和結(jié)腸黏膜中充當(dāng)分子伴侶發(fā)揮重要的細胞保護作用。HSP70分子具有伴侶功能的主要原因基于其與ATP的親和性，其與變性蛋白多肽結(jié)合后，依賴ATP水解釋放出能量來解開多肽鏈的錯誤折疊，使其再次成熟為細胞內(nèi)的正常蛋白，進而使細胞功能和結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)[16]。同時它又可以作為內(nèi)源性保護物質(zhì)對臟器損傷產(chǎn)生自身保護作用[17]。國內(nèi)錢家鳴教授團隊等[13]報道顯示，PZ保護無水乙醇所致大鼠胃黏膜損傷，主要機制是通過促進胃黏膜HSP70表達。PZ通過誘導(dǎo)大鼠HSP70保護小腸上皮細胞免受水楊酸制劑引發(fā)的細胞毒性[18]。PZ通過上調(diào)結(jié)腸上皮細胞內(nèi)HSP27和HSP72表達有效治療過氧化氫誘發(fā)的結(jié)腸黏膜損傷[19]。本組研究顯示，PZ治療組IC大鼠結(jié)腸黏膜HSP70表達顯著高于對照組，PZ可能是通過誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸黏膜HSP70表達加速黏膜愈合。

NF-κB p50是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其活化能調(diào)節(jié)許多促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-8的轉(zhuǎn)錄，故在炎癥中扮演重要作用。Shimada等[20]報道,L-肌鈦鋅能夠抑制胃上皮細胞NF-κB的活性。另有研究[21]報道,HSP72通過穩(wěn)定鈣調(diào)磷酸酶阻止其磷酸化來降低NF-κB的活性。我們的研究同樣顯示，PZ治療組大鼠NF-κB p50表達顯著低于模型組，分析原因可能是大鼠結(jié)腸黏膜促進了HSP70表達，降低了NF-κB p50表達，進而抑制了其活性。

本研究實驗組大鼠給予經(jīng)口飲用PZ藥液，未選擇灌腸途徑給藥，是考慮到實驗研究的靶器官在腸道，如果每天灌腸給藥不可避免會帶來腸黏膜損傷而影響實驗結(jié)果評估。而且，無論是經(jīng)灌腸還是灌胃途徑給藥均會給大鼠增加外源性刺激，使大鼠處于應(yīng)激狀態(tài)，也可能會影響實驗結(jié)果。

綜上所述，PZ能夠減輕IC模型大鼠結(jié)腸黏膜炎癥及糜爛，從而促進腸黏膜損傷的修復(fù)。這可能是通過誘導(dǎo)缺血性損傷的腸黏膜上調(diào)HSP70表達，降低NF-κB p50表達進而抑制其活性有關(guān)。上述結(jié)果為黏膜保護劑PZ對IC患者臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，期待PZ能成為臨床IC防治的選擇藥物。