臧 昕，王家文，林 悅，楊 昆，李 歡，申貴男，李 婧

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

木犀草素(3',4',5,7-Tetrahydroxy Flavone)，具有多樣的生物化學(xué)和藥理作用，如抗菌、抗氧化、降血脂及膽固醇等。近期研究發(fā)現(xiàn)，金銀花、荊芥、菊花等天然中藥材中的木犀草素在用作抗病毒藥物時，對SARS-CoV-2的主要蛋白酶結(jié)合位點具有很高的親和力[1]。木犀草素在與鋅、錳、鎂等微量元素形成配合物后，部分生理活性得到明顯提升，并具有更加多樣的生物特性[2-5]。開發(fā)新型木犀草素金屬配合物，有利于了解黃酮類化合物與金屬的絡(luò)合形式，研究新型具有生理活性的物質(zhì)。本實驗用木犀草素分別與新戊酸酮、苯甲酸銅進(jìn)行反應(yīng)制成銅配合物，分析其化學(xué)組成，并研究配合形式及對DNA的裂解能力。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器、藥品

樣品的紅外譜圖以KBr為壓片材料在Nicolet 380 型紅外光譜儀上測得；紫外譜圖由Thermo Scientific 紫外分光光度計測得；元素分析在Vario Micro cube上測定，凝膠電泳使用美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖譜分析。

瓊脂糖購自Spanish公司；pBR322 DNA購自美國Fermentas公司；EB(溴化乙錠)購自北京博奧拓達(dá)；木犀草素購自上海賢鼎公司。

1.2 合成步驟

1.2.1 配合物1的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇，新戊酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇；將溶液混合并震蕩，置于75℃水浴中回流70 min，冷卻，過濾，收集沉淀，干燥后即得黑色產(chǎn)物，產(chǎn)率為78.66%。IR(峰值，cm-1)：3423 s,1637 m,1590 m,1535 w,1482 s,1350 m,1257 s,809 m。

1.2.2 配合物2的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇，苯甲酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇；將溶液混合并震蕩，置于75℃水浴中回流70 min，冷卻，過濾，收集沉淀，干燥后即得黑色產(chǎn)物，產(chǎn)率為73.35%。IR(峰值，cm-1)：3432 s,1630 m,1600 m,1600 s,1534 w,1480 m,1351 m,1256 m,810 m。

1.3 配合物對pBR322 DNA的裂解實驗

1.3.1 原料與產(chǎn)物對pBR322 DNA的作用能力

以瓊脂糖凝膠電泳法測試木犀草素及其銅配合物對pBR322 DNA的作用效果，并通過美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)來分析所得圖像。

將木犀草素、新戊酸銅、苯甲酸銅、銅配合物1、銅配合物2充分溶解于 DMSO，調(diào)節(jié)各樣品濃度，使其均為300 μg/mL。向每個EP管中加入1 μL的各樣品，接著將6 μL的pH值為7.3的Tris-HCl緩沖溶液加入其中，再滴入1 μL的pBR322 DNA(150 μg/mL)，均勻混合，使體積總和為8 μL；同時以1 μL DMSO溶劑代替樣品，設(shè)置DNA陰性對照組。

將溶液混合均勻，于37℃恒溫、避光的環(huán)境中水浴反應(yīng)3 h。待反應(yīng)時間達(dá)到后，將 2 μL的Loading buffer與剛?cè)〕龅? μL產(chǎn)物迅速、均勻混合，上樣到具有溴化乙錠(1.0 μg/mL)的瓊脂糖凝膠板(瓊脂糖含量：0.8%)上，在電泳儀中加入配制好的TAE緩沖溶液，在80 V/cm的電壓下進(jìn)行持續(xù)電泳。

1.3.2 木犀草素配合物濃度對pBR322 DNA的裂解能力的影響

將配合物1和配合物2的樣品，依次稀釋為7個質(zhì)量濃度：300，225 ，150 ，75，37.5 ，18.75，9.38 μg/mL。取1 μL各濃度的樣品樣品與1μL 的pBR322 DNA(150 μg/mL)作用，操作步驟同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 木犀草素銅配合物產(chǎn)率分析

將木犀草素與新戊酸酮和苯甲酸銅，分別按照以下6種物質(zhì)的量比進(jìn)行反應(yīng)， 0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，反應(yīng)中固定木犀草素用量。反應(yīng)物在乙醇中于75℃恒溫水浴中，持續(xù)反應(yīng)70 min，結(jié)果如下圖1所示。隨著物質(zhì)的量之比不斷增加，至比值為1時，兩種配合物產(chǎn)率均達(dá)到最高，分別為78.66%(配合物1)和73.35%(配合物2)，然后反應(yīng)產(chǎn)率持續(xù)下降。因此物質(zhì)的量之比1∶1為最佳物質(zhì)的量比。在制備配合物的過程中，其他溶劑如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等也用來探索反應(yīng)，但是實驗產(chǎn)品產(chǎn)率均不如在乙醇中好。

圖1 不同物質(zhì)的量之比對產(chǎn)率的影響

2.2 木犀草素銅配合物的化學(xué)表征

2.2.1 紅外譜圖解析

木犀草素與銅配合物1和2的主要紅外吸收峰峰值如表1所示。

表1 木犀草素及其銅配合物的主要紅外吸收峰歸屬

與木犀草素相比較，配合物的羰基C=O吸收峰由1655 cm-1移到1637 cm-1和1630 cm-1，分別減少22 cm-1和25 cm-1，說明兩配合物中C環(huán)上的4-羰基均進(jìn)行了配位。芳環(huán)C=C鍵由1612 cm-1分別減少至1591 cm-1和1600 cm-1。此外，兩配合物于809cm-1和810 cm-1處的特征吸收峰表明均存在金屬氧鍵，證明木犀草素的確與銅離子發(fā)生了配位。配合物中雙酚羥基C-OH的吸收峰分別下降18 cm-1和17 cm-1，說明雙酚結(jié)構(gòu)保存，但由于受配位影響，發(fā)生位移。在配合物1中未發(fā)現(xiàn)新戊酸根的吸收峰，說明新戊酸根沒有參與到配合物的形成，同樣苯甲酸根也沒有參與配合物的形成。以上分析表明，配合物的結(jié)構(gòu)組成為4-羰基，5-羥基配位銅的配合物。

2.2.2 紫外-可見光譜解析

木犀草素與銅配合物1和2的紫外特征吸收帶分布如表2所示。

表2 木犀草素及其銅配合物的紫外主要吸收峰波長

將木犀草素和配合物用DMSO溶解，配置成25 μg/mL的溶液，并在200 nm至600 nm光譜區(qū)間，在紫外分光光度計上進(jìn)行紫外光譜掃描。

木犀草素在紫外光譜中出現(xiàn)兩個特征吸收峰，位于355 nm處吸收峰為帶Ⅰ，是環(huán)B的苯甲?；挥?57 nm處的吸收峰為帶Ⅱ，是環(huán)A的桂皮酰基[6]。這兩處吸收峰均是由于發(fā)生ππ→π*躍遷引起[7]。配合物1和2的帶Ⅱ的吸收峰依次為266 nm和263 nm，較木犀草素有小幅度紅移，帶I的最大吸收峰較木犀草素分別紅移了80 nm和77 nm。

羥基黃酮類化合物通常有兩種配位位點，3'-OH、4'-OH和4-CO、5-OH。文獻(xiàn)報道木樨草素多以4-CO、5-OH的形式發(fā)生配位[7-9]。在本文銅配合物中木犀草素與銅離子發(fā)生配位，配位點也是C環(huán)上的4-CO和A環(huán)上的5-OH，形成穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此類情況配位時，4-CO通過共軛，影響到A環(huán)和B環(huán)兩個共振體系能級降低，從而導(dǎo)致兩個吸收峰發(fā)生紅移。

圖2 木犀草素銅配合物分子結(jié)構(gòu)

綜合上述紅外與紫外譜圖中分析，考慮到峰頂取點誤差，兩組數(shù)據(jù)中吸收峰值的差別可以忽略。因此可以判斷配合物1和2在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相同，且酸根未參與配合物的形成。對配合物進(jìn)行元素分析得到C:55.78%，H:2.96%；理論值C:55.26%，H:3.09%，推斷該配合物的結(jié)構(gòu)式如圖2所示，分子中含有水分子。

2.3 木犀草素銅配合物對DNA裂解作用

作為具有抗四環(huán)素和氨芐青霉素的基因載體，超螺旋pBR322 DNA常常被用于測試化合物抗菌能力[8]。pBR322 DNA的Form I是超螺旋結(jié)構(gòu)，在與金屬作用后會發(fā)生解超螺旋現(xiàn)象，形成Form II。本實驗中，將反應(yīng)所用原料(木犀草素、苯甲酸銅、新戊酸酮)與反應(yīng)所得到的配合物1和配合物2進(jìn)行對DNA裂解能力比較，如圖3所示。木犀草素、苯甲酸銅和新戊酸酮對DNA裂解率分別為4.56%、6.71%、5.13%，基本無裂解能力，而配合物1和配合物2達(dá)到了則78.39%和 82.27%，說明木犀草素與Cu2+發(fā)生配合后，對pBR322 DNA的裂解能力有著顯著提升。此處表明兩種方法合成的樣品，具有相同的性能，進(jìn)一步證明配合物結(jié)構(gòu)相同。

1-Naked DNA；2-木犀草素；3-苯甲酸銅；4-新戊酸酮；5-配合物1；6-配合物2

為了進(jìn)一步研究配合物的裂解作用，實驗選用配合物2測試在不同濃度下對DNA的裂解情況，如圖4。在配合物2中，隨著濃度的提高，裂解率也有著明顯的上升，在75 μg/mL時表現(xiàn)出裂解作用，且在300 μg/mL時，裂解率達(dá)到了最高84.16%。

1-DNA；2-DNA+9.38μg/mL；3-DNA+18.75μg/mL；4-DNA+37.5μg/mL；5-DNA+75.0μg/mL；6-DNA+150 μg/mL；7-DNA+225μg/mL；8-DNA+300μg/mL

3 結(jié)論

木犀草素金屬配合物具有多種生物活性，在本實驗中，利用木犀草素與新戊酸銅和苯甲酸銅分別反應(yīng)生成配合物1和配合物2，利用紅外、紫外光譜等方法分析了木犀草素銅配合物的化學(xué)組成，并初步推測出在這兩種方法下合成的配合物結(jié)構(gòu)相同，木犀草素通過C環(huán)上的4-C=O和A環(huán)上的5-OH與銅發(fā)生配位。此種配位形式在黃酮類化合物金屬配位物中較為典型。通過對pBR322 DNA的裂解活性研究表明，原料樣品對DNA沒有裂解作用，而在生成木犀草素銅配合物后，DNA裂解能力有了明顯的提升，并且隨著濃度的增大，裂解能力增強。此項研究為后續(xù)木犀草素銅配合物的深入研發(fā)奠定基礎(chǔ)。