煙草青枯病不同發(fā)病階段根際土壤微生物群落變化趨勢(shì)分析

黎妍妍，王 林，彭五星，李錫宏*

（1.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030；2.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040；3.恩施州煙草公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445504）

根際是植物-土壤-微生物相互作用的關(guān)鍵微域，每克根際土壤中大約有109個(gè)微生物定殖[1]。在自然界中，植物會(huì)在其根際土壤中積累病原體，這最終會(huì)影響土壤特性[2]，造成的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化又會(huì)引起土壤中物質(zhì)和能量循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解與合成等方面的改變[3]。因此，深入認(rèn)識(shí)土傳病害發(fā)生過(guò)程中根際土壤微生物的變化對(duì)于明確根際土壤微生物與土傳病害的互作關(guān)系具有重要意義。

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種土傳細(xì)菌性病害，每年給煙葉生產(chǎn)造成巨大的產(chǎn)量損失和經(jīng)濟(jì)損失[4]。以往研究通過(guò)分析健康煙田和發(fā)病煙田之間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異，探索了微生物與煙草青枯病之間的關(guān)系[5-7]，但關(guān)于青枯病發(fā)生過(guò)程中根際土壤微生物的變化情況鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，探究煙草青枯病不同發(fā)病階段根際土壤微生物群落特征，以期為進(jìn)一步明確根際土壤微生物群落與青枯病的互作關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

2017 年在湖北省恩施州宣恩縣椒園鄉(xiāng)涼風(fēng)村設(shè)置3 個(gè)煙草青枯病系統(tǒng)調(diào)查點(diǎn)（即3 次重復(fù)），每個(gè)系統(tǒng)調(diào)查點(diǎn)面積為132 m2。調(diào)查田塊土壤類(lèi)型為黃棕壤，土壤肥力中等，海拔約900 m，連年種植煙草，煙草青枯病發(fā)生嚴(yán)重。種植煙草品種為云煙87，移栽期為4 月25 日前后，整個(gè)煙草生育期內(nèi)不施用防治煙草病害的藥物。

1.2 煙草青枯病病情調(diào)查

以株為單位，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 23222—2008《煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法》記載每株煙青枯病發(fā)病嚴(yán)重度，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=。

1.3 煙株根際土壤樣品采集

于烤煙移栽前（0 d），采用5 點(diǎn)取樣法采集各田塊10～25 cm 深的耕層土壤樣品，混合為一個(gè)樣品，記作C_0 d。采用同樣的取樣方法，于烤煙移栽后50、75 和100 d 采集煙株根際土壤樣品[與根系結(jié)合較緊密的土壤（4 mm 內(nèi)）]，混合后分別記作C_50 d、C_75 d 和C_100 d。每個(gè)土樣3 次重復(fù)，共計(jì)12 個(gè)土樣。土樣混勻后，將其置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱中用于DNA 提取。

1.4 土壤微生物群落分析

1.4.1 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 利用FastDNA Spin Kit 試劑盒（MP Biomedicals,USA）提取土壤總DNA。分別用515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；用ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3′）和ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）引物對(duì)真菌ITS1 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為30 μL：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL 引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 1 min；98 ℃10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃5 min（Bio-rad T100 梯度PCR 儀）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina Hiseq PE250 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序（諾禾致源生物信息科技有限公司）。

1.4.2 OTU 聚類(lèi)與物種注釋 利用Uparse 軟件對(duì)所有樣品的Effective Tags 進(jìn)行聚類(lèi)，以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs。對(duì)OTUs 代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肕othur 方法與SILVA 的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行細(xì)菌物種注釋分析，用QIIME 軟件中的blast 方法與Unit 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行真菌物種注釋分析，獲得各分類(lèi)水平上的群落組成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用QIIME 軟件計(jì)算α 多樣性指數(shù)（Sobs、Chao1 豐富度指數(shù)和Shannon 多樣性指數(shù)）。用SPSS 22.0 分析煙草青枯病發(fā)生情況和微生物群落OTU數(shù)量、α 多樣性指數(shù)、物種相對(duì)豐度等在各樣本間的差異（p＜0.05 水平）（One-way ANOVA）；根據(jù)樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，對(duì)相對(duì)豐度前30 位的細(xì)菌屬和真菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到標(biāo)準(zhǔn)化值（樣品在該分類(lèi)上的相對(duì)豐度和所有樣品在該分類(lèi)的平均相對(duì)豐度的差除以所有樣品在該分類(lèi)上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值，即Z值），然后采用HemI 軟件繪制Heatmap 圖。

2 結(jié)果

2.1 煙草青枯病發(fā)生情況

對(duì)煙草青枯病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查與分析（圖1）。結(jié)果表明，烤煙移栽后100 d 時(shí)，煙草青枯病發(fā)病率為97.78%，顯著高于移栽后50 d（22.78%）和75 d（29.44%）的發(fā)病率；煙草青枯病病情指數(shù)為37.41，顯著高于移栽后50 d（3.27）和75 d（5.37）的病情指數(shù)。

2.2 土壤微生物群落多樣性分析

對(duì)根際土壤細(xì)菌和真菌群落α 多樣性指數(shù)進(jìn)行了差異分析（表1）。結(jié)果表明，土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度整體呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)；C_100 d的土壤細(xì)菌群落Sobs、shannon、chao1 指數(shù)和OTUs數(shù)量分別較C_0 d 降低了17.52%、8.00%、17.89%和16.11%，且Sobs 和shannon 指數(shù)均顯著低于其他樣本，OTUs 數(shù)量顯著低于C_50 d 和C_0 d。土壤真菌群落Sobs、shannon、chao1 指數(shù)和OTUs 數(shù)量在各樣本間不存在顯著差異，但C_50 d 樣本的Sobs、chao1 指數(shù)和OTUs 數(shù)量均低于其他樣本，這3 個(gè)指標(biāo)分別較C_0 d 降低了15.28%、18.25%和15.49%。以上結(jié)果表明煙草青枯病發(fā)生對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度的影響較大。

圖1 烤煙移栽后不同時(shí)期煙草青枯病發(fā)生情況Fig.1 The occurrence of tobacco bacterial wilt at different periods post-transplantation

2.3 根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

2.3.1 細(xì)菌群落在門(mén)水平上的組成 平均相對(duì)豐度＞1%的細(xì)菌門(mén)共有10 個(gè)（表2），分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria,35.69%～51.12%）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria,6.69%～18.71%）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria,7.81%～18.39%）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes,5.36%～8.67%）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes,0.76%～5.96%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes,2.85%～4.94%）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi,4.83%～6.72%）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae,1.17%～3.94%）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes,0.88%～3.53%）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia,1.19%～3.82%）。

表1 土壤微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)Table1 The diversity and richness indexes of soil bacteria and fungi in rhizosphere soil

在10 個(gè)細(xì)菌門(mén)中，有6 個(gè)細(xì)菌門(mén)的相對(duì)豐度在各樣本間存在顯著差異。土壤中Acidobacteria、Nitrospirae 和Verrucomicrobia 的相對(duì)豐度隨青枯病病情發(fā)展逐漸降低，且C_75 d 和C_100 d 顯著低于C_0 d；與C_0 d 相比，C_75 d 降低幅度分別為47.74%、59.39%和59.42%，C_100 d 降低幅度分別為57.73%、70.30%和68.85%。Proteobacteria 的相對(duì)豐度則隨青枯病病情發(fā)展逐漸升高，且以C_100 d顯著高于C_0 d、C_50 d 和C_75 d，增加幅度分別為43.23%、35.27%和16.90%。Actinobacteria 的相對(duì)豐度以C_75 d 和C_100 d 顯著高于C_0 d，增加幅度分別為179.67%和125.71%。Firmicutes 的相對(duì)豐度則以C_50 d 和C_100 d 顯著高于C_0 d。以上結(jié)果表明煙草青枯病發(fā)生階段（C_50 d、C_75 d 和C_100 d）與烤煙移栽前（C_0 d）土壤細(xì)菌群落存在較大差異（表2）。

2.3.2 細(xì)菌群落在屬水平上的組成 對(duì)土壤樣本中前30 個(gè)細(xì)菌屬相對(duì)豐度的相似性進(jìn)行了HEMI聚類(lèi)分析（圖2）。結(jié)果表明，C_0 d 與C_50 d 具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，聚為一類(lèi)；C_75 d 與C_100 d具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，聚為一類(lèi)。30 個(gè)細(xì)菌屬可以分為4 組（I、II、III 和IV）?？緹熞圃郧埃–_0 d），土壤中IV 組細(xì)菌屬豐度較高，Z值為1.33±0.24，主要包含H16等6 個(gè)菌屬；移栽50 d（C_50 d）時(shí)，土壤中III 組細(xì)菌屬豐度較高，Z值為1.50±0.00，主要包含Blautia等6 個(gè)菌屬；移栽75 d（C_75 d）時(shí)，土壤中I 組細(xì)菌屬豐度較高，Z值為1.34±0.20，主要包含Ralstonia、Massilia、Blastococcus、Gemmatimonas等7 個(gè)菌屬；移栽100 d（C_100 d）時(shí)，土壤中II 組細(xì)菌屬豐度較高，Z值為1.09±0.40，主要包含Sphingomonas、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas、Bradyrhizobium、Roseiflexus、Lysobacter和Streptomyces等11 個(gè)菌屬。

2.4 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)特征

3 討 論

在清江流域煙區(qū)，煙草青枯病在病程上可劃分為病害首發(fā)期、迅速蔓延期和全面爆發(fā)期，分別對(duì)應(yīng)于烤煙移栽后45～67 d、67～97 d 和移栽后97 d至采收結(jié)束[8]。本研究運(yùn)用擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)探究了煙草青枯病不同發(fā)病階段根際土壤細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)變化，對(duì)于明確根際土壤微生物群落與青枯病的互作關(guān)系具有重要意義。由微生物多樣性分析結(jié)果可知，烤煙移栽75 d 和100 d 時(shí)煙株根際土壤細(xì)菌群落Sobs、shannon 指數(shù)和OTUs 數(shù)量顯著降低，這與WEI 等[9]研究結(jié)果一致；而真菌群落多樣性指數(shù)無(wú)顯著變化。以往研究認(rèn)為，在土壤微生物中，細(xì)菌群落多樣性是評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)平衡和生態(tài)功能的重要因子[10]。因此，隨著煙草青枯病的流行與蔓延，土壤細(xì)菌群落趨向單一化，不利于土壤中微生物種群的平衡[11-12]。

門(mén)水平上，根際土壤細(xì)菌豐度和結(jié)構(gòu)在烤煙移栽 50 d 和 75 d 發(fā)生了明顯的動(dòng)態(tài)變化，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 的相對(duì)豐度顯著升高，Acidobacteria、Nitrospirae 和Verrucomicrobia 的相對(duì)豐度顯著降低。與細(xì)菌群落相比，門(mén)水平上根際土壤真菌群落變化較小，僅Zygomycota 的相對(duì)豐度在烤煙移栽75 d 顯著升高。

與移栽前相比，屬水平上根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)于烤煙移栽后75 d 和100 d、真菌群落結(jié)構(gòu)于烤煙移栽后50 d 和75 d 發(fā)生明顯變化。從功能上講，根際土壤微生物中包含致病微生物、有益微生物等[13]。致病微生物在根際土壤中定殖，努力突破保護(hù)性微生物屏障，克服植物固有的防御機(jī)制，從而導(dǎo)致病害發(fā)生。通過(guò)對(duì)屬水平上土壤微生物群落分析發(fā)現(xiàn)，致病細(xì)菌Ralstonia和致病真菌Fusarium的相對(duì)豐度在青枯病發(fā)生時(shí)明顯升高。本研究中，雷爾氏菌屬Ralstonia僅包含青枯雷爾氏菌R.solanacearum一個(gè)種。青枯菌是導(dǎo)致青枯病發(fā)生的病原菌，在10種重要的植物病原細(xì)菌中，青枯菌位居第2 位[14]。青枯菌相對(duì)豐度于烤煙移栽后75 d 達(dá)到峰值，這可能與烤煙移栽后，其根系分泌的延胡索酸、肉豆蔻酸、肉桂酸、蘋(píng)果酸和草酸等有機(jī)酸促進(jìn)了青枯菌在煙株根部的定殖[15-16]有關(guān)；但隨著青枯病的發(fā)生，根系活力減弱，分泌有機(jī)酸的能力也降低。鐮刀菌屬Fusarium可引起多種植物的萎蔫、根腐[17]，其相對(duì)豐度隨煙草青枯病病情發(fā)展而逐漸升高，于烤煙移栽后100 d 時(shí)達(dá)到峰值。Fusarium可破壞煙株根部，為青枯菌侵染煙株制造天然的入口[18]。

除了致病微生物外，有益微生物也是根際土壤微生物中重要的一類(lèi)，且研究較多。它們通過(guò)刺激植物根生長(zhǎng)、進(jìn)行根際修復(fù)、調(diào)控非生物脅迫和控制病害等促進(jìn)植物生長(zhǎng)[13]。在受到病原菌侵染時(shí)，植株通常能夠調(diào)節(jié)根際土壤微生物群落，特異性地招募具有誘導(dǎo)抗病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益微生物[19]。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。與烤煙移栽前相比，對(duì)土傳病原菌具有拮抗作用或?qū)χ参锷L(zhǎng)具有促生作用的Sphingomonas、Gemmatimonas、Pseudomonas、Lysobacter、Streptomyces等有益細(xì)菌[20-24]和Trichoderma、Gibberella、Chaetomium等有益真菌[25-27]的相對(duì)豐度在青枯病發(fā)生階段明顯升高，表明青枯菌在根際和根系的入侵可能與對(duì)植物無(wú)害甚至有益的某些功能菌具有正相關(guān)[28]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，青枯病煙田根際土壤細(xì)菌群落Sobs、shannon 指數(shù)和OTUs 數(shù)量于烤煙移栽后75 d 和100 d 顯著降低，真菌群落多樣性指數(shù)無(wú)顯著變化。與烤煙移栽前相比，屬水平上根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)于烤煙移栽后75 d 和100 d、真菌群落結(jié)構(gòu)于烤煙移栽后50 d 和75 d 發(fā)生明顯變化。致病微生物（Ralstonia、Fusarium等）和有益微生物（Sphingomonas、Gemmatimonas、Pseudomonas、Lysobacter、Streptomyces、Trichoderma、Gibberella、Chaetomium等）的相對(duì)豐度在青枯病發(fā)生階段明顯升高。