王 黎，徐 郝，俞云棟，張海珍，高燕會，沈 笑，金晨鶯，陳軼敏

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 杭州植物園，浙江 杭州310027；3. 杭州西湖風景名勝區(qū)湖濱管理處，浙江 杭州 310002）

朱頂紅Hippeastrum rutilum又名紅花蓮、孤挺花等，系石蒜科Amaryllidaceae朱頂紅屬Hippeastrum所有種類的總稱，多年生草本植物，性喜溫暖、濕潤氣候，稍耐寒[1]?，F(xiàn)有約70個種[2]在全球呈離散分布，野生種主要集中分布在巴西和玻利維亞一帶。在中國，朱頂紅屬外來引入花卉[3]。朱頂紅花色艷麗且復(fù)雜多變，花瓣形狀豐富，極具觀賞價值，除可用于一般的盆景植物外，還可用于戶外景觀植物栽培，是元旦、春節(jié)和國慶的重要裝飾。目前，國際上流行的園藝雜交種朱頂紅有100多個品種，其中在中國栽培的品種有60多個[4]。作為高檔觀賞花卉，國內(nèi)外開展的對朱頂紅相關(guān)研究，主要集中在栽培技術(shù)(包括組培)、育種、擴繁技術(shù)和病蟲害防治等方面。近年來，育種學(xué)家們培育出了很多花型、花色變化豐富，花瓣厚和花期長的新品種[3]，但在國內(nèi)推廣應(yīng)用的朱頂紅品種主要引自荷蘭，缺少自主培育的新品種，而且朱頂紅的遺傳背景較復(fù)雜，無法確定大部分栽培品種的遺傳背景和品種間的親緣關(guān)系，采用傳統(tǒng)的分類方法很難區(qū)分其種下類群和品種[5]以及朱頂紅種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析數(shù)據(jù)[4]，因此，了解朱頂紅的遺傳多樣性對于朱頂紅遺傳育種具有重要意義。已有研究表明：簡單序列重復(fù)技術(shù)(ISSR)[6?7]已經(jīng)成功應(yīng)用于朱頂紅種質(zhì)資源遺傳關(guān)系分析和品種鑒定，但這并不能完全反映朱頂紅遺傳多樣性。2009年COLLARD等[8]新開發(fā)的基于植物基因組起始密碼子ATG側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計單引物對目的基因進行擴增的新型分子標記技術(shù)——目標起始密碼子多態(tài)性分子標記(start codon targeted polymorphism, SCoT)。ISSR引物擴增介于反向重復(fù)序列位點間的序列[9]，部分序列存在無法擴增的現(xiàn)象。與ISSR標記相比，SCoT標記單引物與ATG結(jié)合后擴增目的基因或其附近DNA序列[10]，有更為廣闊的DNA擴增范圍，其實驗結(jié)果更具有可靠性。目前，SCoT標記已經(jīng)成功應(yīng)用于花生Arachis[11]、茶樹Camellia sinensis[12?13]、梔子Gardenia jasminoides[14]、油菜Brassica rapa[15]、石蒜屬Lycoris[16]、獼猴桃Actinidia[17]、鐵皮石斛Dendrobium officinale[18]等植物遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析和變異鑒定以及基因變異表達等方面。為了更進一步分析更多朱頂紅品種間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，本研究利用建立的SCoT標記體系對朱頂紅品種進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，旨在了解朱頂紅在分子水平上的遺傳變異，為朱頂紅雜交育種、種質(zhì)資源保護和利用提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料朱頂紅采自浙江農(nóng)林大學(xué)遺傳學(xué)科朱頂紅植物種質(zhì)資源圃，共計41個朱頂紅品種(表1)。于2019年4月采集朱頂紅花瓣，液氮冷凍并于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯克靡锸歉鶕?jù)COLLARD等[8]設(shè)計的SCoT引物。

1.2 方法

1.2.1 朱頂紅基因組 DNA 提取與檢測 采用改良 CTAB 法[19]提取朱頂紅花瓣基因組 DNA，采用微量核酸測定儀(Nanodrop 2000)測定DNA的濃度和質(zhì)量，并通過質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格的DNA樣品于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 朱頂紅 SCoT-PCR反應(yīng)體系的建立 為獲得朱頂紅 SCoT-PCR反應(yīng)的最佳體系，參考姜小鳳[20]和潘媛等[14]報道的SCoT擴增反應(yīng)條件，通過對PCR反應(yīng)五要素(模板、引物、MgCl2、dNTPs、rTaqDNA聚合酶)進行5因素4水平正交實驗(，表2～3)。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，PCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 35 s，退火 35 s，72 ℃ 復(fù)性 90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min，16 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物進行質(zhì)量分數(shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 SCoT 引物合成、篩選與擴增 參照 COLLARD 等[8]設(shè)計 SCoT 引物，并由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。引物篩選先利用1個樣品對55條SCoT引物進行初步篩選，選擇條帶清晰的引物，再利用性狀差異較大的3個朱頂紅樣品進行復(fù)篩，選擇條帶清晰、具多態(tài)性條帶的引物進行后續(xù)41份朱頂紅樣品的SCoT-PCR擴增。SCoT-PCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性35 s，退火35 s，72 ℃復(fù)性90 s，36個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表 1 41 個朱頂紅品種性狀描述Table 1 Character description of 41 H. rutilum cultivars used in this stduy

表 2 正交實驗因素及水平Table 2 factors and levers of orthogonal design

表 2 正交實驗因素及水平Table 2 factors and levers of orthogonal design

水平因素 引物/(μmol·L?1) MgCl2/(mmol·L?1) DNA/ng dNTPs/(mmol·L?1) rTaq/(×16.67 nkat)1 0.1 1.5 30 0.1 0.50 2 0.2 2.0 40 0.2 0.75 3 0.3 2.5 50 0.3 1.00 4 0.4 3.0 60 0.4 1.25

表 3 朱頂紅 SCoT-PCR 正交試驗體系篩選Table 3 Screening of orthogonal systems

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 由于引物與DNA結(jié)合點可由瓊脂糖凝膠電泳圖譜的條帶表示，因此，PCR電泳圖中的每個條帶就是1個位點。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，記錄重復(fù)的DNA電泳條帶峰同一引物的擴增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為“1”，沒有條帶記為“0”，并建立矩陣，只記錄易于辨認的條帶，排除模糊不清的條帶。利用Excel計算多態(tài)性條帶百分比(percentage of bands，PPB)。根據(jù)“1，0”矩陣并使用NTSYspc軟件計算遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，依據(jù)SHAN程序按照非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)法構(gòu)建朱頂紅樣品間的聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 質(zhì)量濃度與質(zhì)量檢測結(jié)果

采用改良CTAB法提取朱頂紅基因組DNA，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，各泳道朱頂紅基因組DNA條帶清晰、亮度好(圖1)，點樣孔附近無雜質(zhì)殘留，表明提取DNA完好，降解少；使用微量核酸測定儀檢測DNA質(zhì)量濃度與純度，吸光度值D(260)/D(280)為1.88～2.00，表明提取的朱頂紅基因組DNA純度較高，雜質(zhì)較少；經(jīng)測定朱頂紅DNA質(zhì)量濃度為80.0～896.2 mg·L?1，可滿足后續(xù)實驗要求。

圖 1 部分朱頂紅樣品 DNA 電泳圖Figure 1 DNA electrophoresis of some samples of H. rutilum

2.2 朱頂紅 SCoT-PCR 體系的建立

2.3 朱頂紅 SCoT 引物篩選

利用建立的SCoT體系從55條SCoT引物初篩出32條條帶多且清晰的引物(圖3)，再用3個花色差異較大的朱頂紅樣品(‘婚禮舞曲’‘紅獅’‘迷霧’)對32條SCoT引物進行復(fù)篩(圖4)，最終篩選到12條條帶清晰且多態(tài)性良好的SCoT引物，用于后續(xù)41份朱頂紅樣品SCoT- PCR擴增。

圖 2 SCoT 引物 P55 正交試驗篩選結(jié)果電泳圖Figure 2 Electrophoretic map of the results of orthogonal test with SCoT primer P55

圖 3 部分 SCoT 引物初篩圖Figure 3 Preliminary screening of SCoT primers

圖 4 部分 SCoT 引物復(fù)篩電泳圖Figure 4 Electrophoretic map of secondary screening using partial SCoT primers

2.4 朱頂紅SCoT-PCR擴增結(jié)果分析與多態(tài)性分析

利用12條引物對41個朱頂紅品種的DNA進行PCR擴增，產(chǎn)物分布在 200～3 000 bp，共擴增出89條清晰的條帶，每條引物擴增的條帶數(shù)為5～11條，其中，P56擴增條帶數(shù)最多，可達11條，多態(tài)性條帶11條；P5擴增條帶數(shù)最少為5條，多態(tài)性條帶4條，平均每條引物擴增條帶為7.42條。多態(tài)性條帶合計77條，平均每條引物可擴增出的多態(tài)性位點為6.42條，多態(tài)性比率為86.52%。多態(tài)性最高的引物是P32、P40和P56均達100%；而引物P12的多態(tài)性最低，僅有60%(表4)。以上結(jié)果表明：SCoT分子標記適用于朱頂紅的多態(tài)性位點的檢測，便于朱頂紅品種間的遺傳多樣性的分析。

表 4 SCoT 標記引物擴增結(jié)果Table 4 Amplification results of SCoT marker primers

2.5 朱頂紅遺傳多樣性分析

根據(jù)12條多態(tài)性良好的SCoT引物對41份朱頂紅樣品的擴增結(jié)果，使用NTSYspc軟件計算品種遺傳相似系數(shù)。41份朱頂紅品種間共獲得861個相似系數(shù)組成相似性矩陣，41份朱頂紅樣材料兩兩之間的相似系數(shù)為0.292 3～0.833 3，平均為0.498 4。其中，2號‘愛神’和3號‘冰后’相似系數(shù)最大(0.833 3)，表明兩者之間親緣關(guān)系較近；23號‘奇妙仙子’和41號‘迷霧’相似系數(shù)最小(0.292 3)，表明兩者之間親緣關(guān)系較遠，相差較大。

同時，對41份朱頂紅品種的遺傳相似系數(shù)進行統(tǒng)計分析，以0.054 1為間距，分成10組，分析基因相似系數(shù)的頻數(shù)條形圖(圖5)。大部分朱頂紅品種種間相似度集中在 0.400 7～0.563 2，數(shù)目為524個，所占比例為63.91%；剩下的基因相似系數(shù)在兩側(cè)呈不對稱分布。表明朱頂紅不同品種之間存在明顯差異，具有豐富的遺傳多樣性。對相似性最高的10對品種的瓣型花色進行比對可以發(fā)現(xiàn)：相似性高的品種間瓣型具有高度的一致性(100%)，而花色的一致性較低(40%)，說明朱頂紅在花色方面的遺傳多樣性更為豐富。

圖 5 基于 SCoT 標記的朱頂紅品種間遺傳相似系數(shù)頻數(shù)分布直方圖Figure 5 Histogram of number distribution of genetic similarity coefficient among red varieties based on SCoT markers

2.6 SCoT 聚類分析

利用NTSYS 2.1軟件中的非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)對41份朱頂紅品種進行聚類分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(圖6)。由圖6可知：在遺傳相似系數(shù)的0.42處可以將41份朱頂紅品種劃分為2個大類，說明這2個類群之間有較為明顯的差異。第Ⅰ大類有34個品種，既有重瓣品種又有單瓣品種，第Ⅰ大類又分為4個小類，其中Ⅰa類中，白色的2號‘愛神’和3號‘冰后’聚在一起，橙紅色6號‘鬼魅’、8號‘快車’和紅色的7號‘黑天鵝’聚在一起；Ⅰb小類多為紅色系列，而且還有多個由白色和紅色形成的復(fù)色花，如4號‘焦點’、24號‘瑞貝卡’、25號‘世外桃源’和13號‘紅唇’；Ⅰc小類多為紅色繁殖類，其中白色的可能是品種變異的結(jié)果；Ⅰd小類中單瓣、白色的20號‘繡球’和紅色的22號‘奇跡’是重瓣、橙紅和白色組成的復(fù)色花(21號‘迎春’)的可能親本；第Ⅱ大類品種較為簡單，包括35號‘世界和平’、36號‘北極女神’、37號‘首映’、38號‘圣誕快樂’、39號‘清晨陽光’、40號‘超級黛絲’、41號‘迷霧’在內(nèi)的7個品種(系)，除36號‘北極女神’和37號‘首映’為重瓣外，均為單瓣，且多為復(fù)色花。

圖 6 基于 SCoT 標記的 41 份朱頂紅品種聚類圖Figure 6 Cluster analysis charts of 41 vermilion red based on SCoT marker

3 討論與結(jié)論

朱頂紅是國際市場上常用的觀賞植物，其種間雜交育種技術(shù)極大地豐富了朱頂紅品種(系)，具有較高的經(jīng)濟價值。但目前，朱頂紅品種改良和選育主要以傳統(tǒng)的雜交育種方式為主，從自然雜交、人工雜交的后代中分離優(yōu)良性狀單株，通過2～3 α培育后鑒定花瓣性狀、花色等形態(tài)學(xué)特征，性狀不同于親本且具有穩(wěn)定遺傳性狀的被認定為新品種。此類育種方法工作年限長且進展緩慢，無法區(qū)分真假雜交種，有極大可能面臨育種失敗的風險。

近年發(fā)展起來的SCoT分子標記技術(shù)兼具操作簡單、多態(tài)性高、遺傳信息豐富、成本低和引物通用性強等特點[21]，是一種分析物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系有效的分子標記輔助育種技術(shù)，為植物種質(zhì)鑒定和指紋圖譜構(gòu)建等研究提供了新的技術(shù)手段；它可以排除外界環(huán)境帶來的表觀遺傳變化，從基因組水平真實反映材料的遺傳基礎(chǔ)與特征，從而快速判斷是否為新品種，極大地縮短育種年限，降低育種成本。SCoT標記技術(shù)已應(yīng)用于園林植物育種中，如玫瑰Rosa rugosa雜交種后代早期選擇、遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析等方面[21]。本研究應(yīng)用12條SCoT引物對41份朱頂紅品種進行PCR擴增后均檢測到清晰的條帶，平均多態(tài)性條帶比率高達86.52%，品種間遺傳相似系數(shù)為0.292 3～0.834 3，與利用ISSR分子標記檢測61份朱頂紅品種間(遺傳相似系數(shù)為0.371 4～0.842 9)[6?7]的結(jié)果相比，本實驗的朱頂紅品種間的遺傳范圍更廣泛，遺傳多樣性更高，可為朱頂紅的新品種選育提供基礎(chǔ)。聚類結(jié)果表明：本研究的41個朱頂紅品種沒有完全按照花的瓣型，而是根據(jù)遺傳相似系數(shù)混合聚類，多數(shù)花色性狀相似品種被聚在一起，如第Ⅱ大類多為紅色和白色組成的復(fù)色花。這與張林等[6?7]利用ISSR標記對61個朱頂紅品種的聚類不太一致，可能是由于SCoT標記技術(shù)是一種能跟蹤性狀，并獲得與性狀相關(guān)目的基因的新型分子標記技術(shù)；利用SCoT標記技術(shù)還可以初步判斷可能的雜交親本，如Ⅰd小類中單瓣、白色的‘繡球’(20號)和紅色的‘奇跡’(22號)是重瓣，橙紅和白色組成的復(fù)色花(21號‘迎春’)的可能親本。此假設(shè)可以在后期分子水平實驗中進一步驗證。

本研究成功有效地利用SCoT標記技術(shù)研究了朱頂紅品種間的遺傳多樣性和對可能親本的鑒定。今后可從朱頂紅種質(zhì)資源圃中選擇親緣關(guān)系較遠的可育品種作為親本，進行品種間雜交，培育花色豐富和花型多樣的朱頂紅新品種，進一步改良和選育朱頂紅的新品種。