低雙乙酰釀酒酵母的復(fù)合誘變選育研究

李忠英 羅躍中 王瀟蕤

摘 ?要：雙乙酰是啤酒發(fā)酵時產(chǎn)生的一種非常重要的發(fā)酵副產(chǎn)物，也是判斷啤酒是否成熟的重要標準。文章主要是對低雙乙酰釀酒酵母的復(fù)合誘變選育進行探索研究，通過進行誘變選育來選擇雙乙酰值比較低的啤酒酵母菌株，并用于啤酒的釀造，使雙乙酰值能夠符合標準。

關(guān)鍵詞：低雙乙酰;釀酒酵母;誘變選育

中圖分類號：Q813.5 ? ? ? ?文獻標志碼：A ? ? ? ? 文章編號：2095-2945（2020）32-0065-02

Abstract： Diacetyl is a very important fermentation by-product produced during beer fermentation， and it is also an important standard to judge whether the beer is mature or not. The main purpose of this paper is to explore the compound mutagenesis breeding of low diacetyl saccharomyces cerevisiae， select the beer yeast strain with relatively low diacetyl value through mutagenesis breeding， and use it in beer brewing， so that the diacetyl value can meet the standard.

Keywords： low diacetyl; saccharomyces cerevisiae; mutagenic breeding

引言

雙乙酰是一種獨特的風(fēng)味物質(zhì)，其特征是帶有一股類似于餿飯的味道。在生產(chǎn)啤酒時，啤酒的成熟度以及口感可以通過檢測雙乙酰的含量來判斷，其風(fēng)味閾值是0.2ppm。其前驅(qū)體為a-乙酰乳酸，a-乙酰乳酸是經(jīng)過啤酒酵母的幫助在乙酰羥酸合成酶的作用下產(chǎn)生的，并且經(jīng)過非酶氧化的途徑在細胞的外部產(chǎn)生雙乙酰。對其含量進行合理的控制能夠使啤酒的口感得到保證。在啤酒生產(chǎn)中，如何降低雙乙酰的含量，從而提高啤酒的質(zhì)量，是啤酒生產(chǎn)企業(yè)面臨的直接問題。本文采用用紫外和微波對啤酒酵母進行誘變育種的研究，以此來獲得SM抗性突變株。經(jīng)發(fā)酵后，檢測其雙乙酰的含量，選擇雙乙酰含量比較低的菌株。

1 啤酒發(fā)酵時雙乙酰的產(chǎn)生機制以及分解途徑

雙乙酰是影響啤酒整體風(fēng)味的重要因素，也是判斷啤酒是否成熟的重要標準，它是小麥經(jīng)過了多種變化后的產(chǎn)物。在啤酒中，雙乙酰的風(fēng)味閾值一般為每升0.15mg，如雙乙酰含量超標，就會導(dǎo)致啤酒出現(xiàn)不良口味，讓啤酒產(chǎn)生一種餿飯味，使其口感降低。因此，在啤酒的生產(chǎn)過程中，必須降低雙乙酰的含量，使其控制在合適的范圍內(nèi)，提高啤酒品質(zhì)。在進行啤酒的發(fā)酵時， 啤酒酵母會產(chǎn)生大量的a-乙酰乳酸，但是由于其合成以及分解的不平衡，容易導(dǎo)致其在啤酒酵母不斷的積累，而其中會有一部分分泌到了細胞之外的啤酒發(fā)酵液中，經(jīng)過反應(yīng)后產(chǎn)生雙乙酰。啤酒酵母可以通過反應(yīng)產(chǎn)生還原酶，將雙乙酰通過反應(yīng)后進行還原，變成乙偶姻，經(jīng)過降解反應(yīng)后生成丁二醇，但是丁二醇和乙偶姻對啤酒的口感等因素沒有任何的影響。不過啤酒在進行后期發(fā)酵時，酵母的含量大大減少，使得雙乙酰的還原效率非常低，需要很久的時間才能將啤酒中的雙乙酰降到合理的值，從而對啤酒的生產(chǎn)周期產(chǎn)生了很大的影響[1]。

2 啤酒生產(chǎn)中控制雙乙酰的途徑

控制啤酒中的雙乙酰的含量的途徑有以下三個途徑，第一是控制a-乙酰乳酸的量，在進行啤酒生產(chǎn)時，雙乙酰是啤酒酵母合成纈氨酸和亮氨酸過程中產(chǎn)生的，抑制a-乙酰乳酸的產(chǎn)生，從而直接達到控制啤酒中雙乙酰的目的。第二是提高a-乙酰乳酸的降解速度，在啤酒發(fā)酵時，a-乙酰乳酸需要漫長的非酶促氧反應(yīng)才能生成雙乙酰，但是如果將發(fā)酵液中的a-乙酰乳酸直接轉(zhuǎn)化為乙偶姻，跳過產(chǎn)生雙乙酰的中間步驟，就可以達到降低雙乙酰含量的目的。第三種方式是使雙乙酰的轉(zhuǎn)化速度加快，一旦提高雙乙酰的轉(zhuǎn)化速度，就可以直接控制啤酒中的雙乙酰含量[2]。

2.1 定向的馴化篩選雙乙酰降解速度比較快的酵母菌株

通過人為的因素讓菌株向著規(guī)定的方向進行發(fā)展是一種進行微生物選擇的一種有效方法。有研究發(fā)現(xiàn)，將酵母菌APV涂抹在雙乙酰的培養(yǎng)基中，經(jīng)過了6代的定向馴化，從中篩選出了優(yōu)質(zhì)的菌種，發(fā)酵實驗表明，雙乙酰在啤酒發(fā)酵液中降低了接近五分之一。

2.2 誘變獲得雙乙酰低產(chǎn)酵母菌株

通過誘變方式進行低雙乙酰酵母菌株進行選育，通過紫外誘變獲得的產(chǎn)低雙乙酰酵母突變株，其發(fā)酵后的雙乙酰含量比原始的菌株降低了20%左右，而其他的生物特征卻沒有發(fā)生明顯變化。張智維等[4]利用激光誘變的方式獲得了一株效果非常好的酵母突變株，其雙乙酰含量僅僅為0.26mg/L，只有原值菌株的一半左右。

2.3 高溫發(fā)酵

酵母內(nèi)酶的作用與溫度密切相關(guān)，在保證酶活性的前提下，溫度越高，則反應(yīng)的效果越快，故在一定程度上合理的提高發(fā)酵的溫度，可以使雙乙酰的還原速度加快，使發(fā)酵的周期縮短，提高生產(chǎn)效率。在啤酒的生產(chǎn)旺季時，適當?shù)奶岣甙l(fā)酵的溫度可以有效的使生產(chǎn)能力加快。本生產(chǎn)工藝發(fā)酵溫度為11℃左右，其發(fā)酵周期為25天左右，進入后期發(fā)酵期時，第十五天其雙乙酰的含量為0.11mg/L。因我校有10T的原漿啤酒，所以將其發(fā)酵溫度提高至14℃時，其發(fā)酵周期為18天，在第十五天再次進行雙乙酰的測量，其含量僅為0.08mg/L，這充分說明了提高發(fā)酵溫度可以有效的降低雙乙酰的含量，從而使發(fā)酵周期大大縮短[5]。

3 低雙乙酰誘變育種的研究

3.1 通過紫外進行誘變育種

紫外誘變育種的方法操作簡便，使用效率高，操作時安全，所以在誘變育種中受到了比較廣泛的使用，其波長在250mm時最適合用來誘變育種。此時的DNA吸收量最大，嘧叮對于紫外線的敏感度比較強，紫外線作用的產(chǎn)物主要是兩個嘧啶之間形成二聚體，它會減弱雙鏈之間氫的作用，導(dǎo)致雙鏈結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形，阻礙堿基之間的配對，引發(fā)DNA發(fā)生突變或者直接死亡。嘧啶二聚體不僅可以通過單鏈上相鄰的嘧啶之間的反應(yīng)，對于雙鏈相對應(yīng)的兩個嘧啶之間也可以發(fā)生反應(yīng)，從而對DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄進行影響。紫外線還能夠引起堿基的突變和缺失等。

3.2 激光誘變育種

激光是一種量子流，可根據(jù)其波長的不同劃分為紫外激光、N2激光等。激光誘變是屬于物理的范疇，其產(chǎn)生反應(yīng)的來源是其產(chǎn)生的光、電、熱以及磁效應(yīng)所產(chǎn)生的聚合作用。引起生物的分子出現(xiàn)變異，電磁場產(chǎn)生的自由基，導(dǎo)致生物的DNA出現(xiàn)損傷或者突變，而熱效應(yīng)導(dǎo)致酶失去原有的活性，出現(xiàn)生理或者遺傳變異。低功率的激光誘變育種能夠?qū)ι矬w產(chǎn)生遺傳或者變異的主要因素是激光的光效應(yīng)或者是電磁場效應(yīng)。激光誘變技術(shù)在生物育種中使用的比較廣泛。紅外或者紫外的波長，每個階段都有不同的效果。激光誘變是一種新型的育種技術(shù)，相對于紫外誘變或者化學(xué)誘變而言，它具有能量高、方向性好等特點，故在生物育種中得到了廣泛的使用。有研究通過使用He-Ne激光對釀酒酵母進行了誘變處理，經(jīng)過后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母的細胞分裂受到了很大程度的影響，對100多株菌類進行了研究，收獲了3株出現(xiàn)突變的菌株。乙醇率比沒有經(jīng)過突變的菌株提高了0.08。

3.3 通過微波輻射進行誘變育種

微波輻射用來誘變育種其生物效應(yīng)的來源也是光、電、熱以及磁效應(yīng)所產(chǎn)生的綜合作用。這種誘變育種方式操作簡便，效率高。因此生物育種方面值得研究。微波的本質(zhì)是一種波，其能夠使生物產(chǎn)生反應(yīng)的區(qū)間為300MHz左右。將微波投入到生物的研究中，主要表現(xiàn)方式為兩點，即熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)的反應(yīng)過程是生物中的蛋白質(zhì)分子在受到微波的強烈刺激時，會隨著外場的變化而轉(zhuǎn)動，從而使各分子之間會出現(xiàn)劇烈的摩擦，進而產(chǎn)生能量，使溫度出現(xiàn)上升，引起生物的生理反應(yīng)甚至是死亡。而非熱效應(yīng)到目前為止也沒有詳細的定論，但是有幾種解釋比較合理：第一種為微波的交變電場對微生物細胞內(nèi)部的DNA產(chǎn)生了洛倫茲力，使其產(chǎn)生運動，從而導(dǎo)致了DNA的突變。第二種為微波具有穿透性，使細胞內(nèi)部和外部的水分子產(chǎn)生劇烈的運動，使細胞的代謝速度加快，更加容易分泌。第三為微波可以讓水分子在短短的一秒鐘內(nèi)轉(zhuǎn)動24億多次，其強烈的運動使細胞內(nèi)的DNA分子的氫鏈出現(xiàn)了一定程度的損壞，導(dǎo)致DNA的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同的變化。早在上世紀70年代，就有研究人員在微波中進行了菌體、病毒孢子等低等真核生物的突變實驗。在此之后，微波誘變在沙門氏菌、酵母等誘變育種中效果較好[6]。

3.4 離子注入誘變育種

離子注入的原理是讓離子進入到生物體內(nèi)，導(dǎo)致生物出現(xiàn)變異。離子注入具有突變幾率非常高，生物死亡的幾率低等特點。在生物的誘變育種領(lǐng)域受到了非常普遍的使用。其具有獨特性。第一，離子注入會產(chǎn)生集合能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積、電荷中和為一體的生物效應(yīng)。從而導(dǎo)致生物體產(chǎn)生染色體重復(fù)，DNA破裂、死亡等多種生物效應(yīng)。第二，離子注入不同于電荷、能量等組合，可以提供很多誘變所需要的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而使其發(fā)生多種變化。第三，離子注入擁有多種選擇區(qū)域，其效果可控，可以多生物進行指定區(qū)域的誘變，其注入的參數(shù)和種類都處于可控范圍內(nèi)，使其注入的各項參數(shù)可以根據(jù)需要進行組合，為生物的誘變提供了新的途徑[7]。

4 結(jié)束語

本文采用紫外誘變育種、激光誘變育種、微波輻射誘變育種以及離子注入誘變育種等方式對低雙乙酰釀酒酵母的復(fù)合誘變選育進行了研究，并對每個誘變育種都進行了詳細的分析，效果明顯。在如今激烈的市場競爭中，啤酒的質(zhì)量是取勝的關(guān)鍵，只有選擇雙乙酰值比較低的啤酒酵母菌株，對啤酒中雙乙酰的指標進行嚴格的控制，從啤酒質(zhì)量上取得競爭優(yōu)勢。

參考文獻：

[1]陳茉.低雙乙酰啤酒酵母的誘變育種研究[D].黑龍江：黑龍江大學(xué)，2010.

[2]王芬.優(yōu)良啤酒釀造酵母菌株選育途徑的探討[D].福建：廈門大學(xué)，2007.

[3]屠令臣，劉鳳珠，王連合，等.全小麥啤酒酵母菌株“商啤3號”的誘變育種及應(yīng)用研究[Z].河南府泉酒業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州輕工業(yè)學(xué)院，2008.

[4]張智維，王旭，劉金平.He-Ne激光誘變選育雙乙酰生成量低的啤酒酵母[J].激光技術(shù)，2005，29（5）：541-542，557.

[5]汪志君，高慶，方維明，等.紫外誘變篩選低高級醇和雙乙酰含量的啤酒酵母[J].中國釀造，2005（1）：13-17.

[6]北京燕京啤酒股份有限公司.一種釀酒酵母誘變菌株及其應(yīng)用：CN201510416932.9[P].2015-11-04.

[7]張智維，張璐，代春吉.低雙乙酰啤酒酵母激光誘變條件的研究[J].中國釀造，2005（3）：27-28.