檳榔芋軟腐病生防真菌的篩選

董曉菲 葉祖云 劉雨虹 黃林榕 李珊

摘要：[目的]以福鼎檳榔芋為研究對象篩選生防菌株，為檳榔芋軟腐病生物防治提供可用菌株。[方法]從福鼎檳榔芋根際土壤和健康植株球莖內分離得到12株真菌，經離體球莖試驗篩選，共篩選出9株對檳榔芋軟腐病具有防治效果的真菌菌株。對這9株菌株進行分子鑒定、常規(guī)形態(tài)特征觀察、生理生化測定和田間活體防效等，進一步篩選可用菌株。[結果]得到2株有較好防治效果的菌株CAF-H001和CAF-L002.擴增菌株的ITSl/ITS4DNA，經測序后與NCBI數據庫進行同源性比對，結果顯示菌株CAF-H001與藤倉鐮刀菌（Fusariumfujikuroi）相似度100%，菌株CAF-L002與塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）相似度100%。其中，菌株CAF-H001為白色菌體，細長型分生孢子，最適pH為9，最適溫度為28℃，以淀粉作為碳源、蛋白胨作為氮源時生長最佳;菌株CAF-L002為黑褐色菌體，球形分生孢子，最適pH為8，最適溫度為32℃，以淀粉作為碳源、酵母浸粉作為氮源時生長最佳。[結論]本研究分離鑒定的菌株CAF-H001和CAF-L002分別為藤倉鐮刀菌和塔賓曲霉，具有較好的生防應用價值，為檳榔芋軟腐病的生物防治提供了基礎。

關鍵詞：檳榔芋;軟腐病;生物防治

中圖分類號：S436.32文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）05-0538-07

0 引言

（研究意義）檳榔芋（Colocasia esculenta L var.coFmos～Is Chang）屬天南星科多年生單子葉宿根性草本植物，營養(yǎng)豐富，有較高的市場價值。2011年11月22日，中華人民共和國農業(yè)部批準對“福鼎檳榔芋”實施農產品地理標志登記保護。目前檳榔芋產業(yè)已成為福建省福鼎縣農業(yè)增收的支柱產業(yè)，種植面積超過2000hm²，產值逾3億元。軟腐病是影響檳榔芋產量的最主要因素之一，株發(fā)病率一般為3%～15%，嚴重時超過50%甚至絕收，非常挫傷芋農積極性。軟腐病菌為細菌，多在檳榔芋球莖或葉柄基部發(fā)病，病菌于土壤或球莖中越冬，通過傷口、氣孔侵入，經昆蟲接觸或灌溉流水蔓延造成再次侵染，25-30℃時最易發(fā)病，暴風雨、高溫高濕、連作地等極易傳播，發(fā)病嚴重，對檳榔芋的產量和當地經濟造成巨大影響，且用輪作、化學殺菌劑等方式防治收效甚微、作用時間短，化學防治方法易產生環(huán)境安全和食品安全的隱患。（前人研究進展）生物防治高效且無毒，可有效保留環(huán)境里的有益微生物，符合人們對綠色食品的需求，且利于農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用有益微生物可有效控制病害，目前已有對黃瓜、柑橘、甜瓜等作物的病害進行微生物防治的研究。周麗洪等分離鑒定了3株內生菌對魔芋細菌性軟腐病具有顯著防控作用的生防菌株，其田間生物防治效果可達57%～79%。目前檳榔芋軟腐病的防治主要采取綜合防治技術，即農業(yè)栽培、物理人工、化學藥劑防治相結合，偏向于防重于治。（本研究切入點）關于檳榔芋軟腐病生物防治方面的研究尚比較缺乏。（擬解決的關鍵問題）本試驗在前期分離鑒定軟腐病病原菌的基礎上進一步篩選生防菌株，探究其作用效果和使用方法，以期為檳榔芋軟腐病的防治提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品：土樣和健康檳榔芋球莖均采自福建省福鼎市貫嶺鎮(zhèn)河坑村檳榔芋種植田地（120°1144"E，27°22′16”N），選取不同種植地塊，在地塊靠中心處，用高溫滅菌過的小鏟和剪刀進行取樣，其中土樣取深度10～15cm的健康檳榔芋植株根際土壤3處各200g，健康檳榔芋球莖5棵，分別裝入自封袋并做標記，放人裝有冰袋的泡沫箱中帶回實驗室4℃保存，并于3天內使用。檳榔芋軟腐病病原細菌來源于實驗室前期分離鑒定菌株（菌株編號141108）。

主要試劑：PDA培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基，0.1%升汞，75%酒精，棉蘭染液等。

儀器：生化培養(yǎng)箱（上海齊欣，KLH-250FD），PCR儀（德國，Biometra），超凈工作臺（蘇州凈化，SW-CJ-2D），電泳儀（北京六一，DYY-10C），超純水器（香港力康，Easyl5），高壓滅菌鍋（美國致微，GR60-DA），生物顯微鏡（寧波舜宇，E5）等。

1.2 試驗方法

1.2.1真菌的分離純化 參考方中達的方法。土壤分離真菌：稱取10g土壤放人盛有90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，依次稀釋成10^-1、10^-2、10^-3、10^-1、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀釋液。分別吸取上述稀釋液100uL均勻涂于PDA培養(yǎng)基平板上，每個濃度梯度涂3皿，于28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3～5d，每天觀察生長情況。內生菌分離真菌：將健康的檳榔芋球莖洗凈后切取成5×5×5cm組織塊，75%酒精浸泡1min，無菌水漂洗，再用0.1%升汞表面消毒1-2min，用無菌水沖洗3次后晾干。用無菌刀將表面消毒后的組織塊切成約0.5×0.5×0.5cm的小塊，分別置于無菌研缽中加5mL無菌水研磨成漿狀，靜置10min，將組織研磨液梯度稀釋10～1000倍，分別取100uL涂布到PDA培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度涂布3皿，于28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3～5d，每天觀察生長情況。待長出菌落后，根據菌落形態(tài)、顏色等性狀將不同的單菌落挑出，采用平板劃線法在PDA培養(yǎng)基上進行分離純化，純化2～3次，直至分離出單菌落，于斜面試管4℃冰箱保藏。

1.2.2生防菌的離體球莖篩選 參考陳嬌梅等的方法略有改動。將分離純化的真菌和軟腐病病原細菌分別接種于PDA、NA液體培養(yǎng)基中，真菌于28℃、220r·min^-1搖床培養(yǎng)3d，病原細菌于37℃、220r·min^-1搖床培養(yǎng)8h，備用。選取健康檳榔芋球莖，洗凈并風干后，切取大小為長3cm×3cm×0.7cm的組織塊，75%酒精消毒30s后用0.1%升汞液消毒5min，無菌水充分滌蕩5次，再放人有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每皿放人一組織塊，備用。將軟腐病病原菌液和待測真菌液以1：1比例混合，用無菌刀和鑷子在處理的組織塊中央劃長1cm、寬1cm、深約0.3cm的十字傷口，接種20uL混合菌液于組織塊十字中央。以無菌水接種為陰性對照，軟腐病病原菌液接種為陽性對照，每個真菌處理重復3皿，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d，觀察記錄并拍照。