王超 王曉娟 朱美榮 萬玉剛

[摘要] 目的 探討蛇葡萄素對實驗性結(jié)腸炎大鼠Treg/Th17細胞分化的影響。 方法 48只雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組，模型組、高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組，每組8只。除對照組外，其余5組大鼠均使用三硝基苯磺酸建立實驗性結(jié)腸炎模型。造模3 d后，藥物治療7 d，高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素，柳氮磺吡啶組灌胃柳氮磺吡啶100 mg/（kg·d），對照組灌胃定量生理鹽水。比較6組轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、白細胞介素-10（IL-10）、IL-17、叉頭轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子5（STAT5）、維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt）、STAT3、IL-35表達水平。 結(jié)果 模型組病理損傷評分明顯高于對照組（P < 0.05）;高、中劑量組和柳氮磺吡啶組病理損傷評分低于模型組（均P < 0.05）。模型組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平低于對照組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）。高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平高于模型組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。 結(jié)論 蛇葡萄素可以調(diào)節(jié)實驗性結(jié)腸炎大鼠Treg/Th17細胞分化，增強細胞功能。

[關(guān)鍵詞] 蛇葡萄素;實驗性結(jié)腸炎;白細胞介素;轉(zhuǎn)錄因子;調(diào)節(jié)性T細胞;輔助性T-17細胞

[中圖分類號] R574.62? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（a）-0019-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Ampelopsin on the differentiation of Treg/Th17 cells in experimental colitis rats. Methods Forty-eight male SD rats were divided into control group， model group， high dose group， medium dose group， low dose group and Sulfasalazine group by random number table method， with eight rats in each groups. Except for control group， the other five groups of rats were used Trinitrobenzene Sulfonic Scid to establish experimental colitis model. After three days of modeling， drug treatment was given for seven days. Rats in high， medium， and low dose groups were given 500， 250 and 125 mg/（kg·d） of Ampelopsin respectively， and Sulfasalazine group was given 100 mg/（kg·d） of Sulfasalazine， and control group was given quantitative normal saline. The levels of transformed growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-10 （IL-10）， IL-17， forkhead box P3 （Foxp3）， signal transducers and activators of transcription 5 （STAT5）， retinoic related orphan receptor γt （RORγt）， STAT3 and IL-35 in six groups were compared. Results The pathological injury score of model group was higher than that of control group （P < 0.05）; and the pathological injury scores of high， medium dose groups and Sulfasalazine group were lower than those of model group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of model group were lower than those of control group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were higher than those of control group （all P < 0.05）. The expression levels of TGF-β1， IL-10， IL-35， Foxp3 and STAT5 of high， medium， low dose groups and Sulfasalazine group were higher than those of model group， while the expression levels of IL-17， RORγt and STAT3 were lower than those of model group （all P < 0.05）. Conclusion Ampelopsin can regulate Treg/Th17 cell differentiation and enhance cell function in experimental colitis rats.

[Key words] Ampelopsin; Experimental colitis; Interleukin; Transcription factor; Regulatory T cells; Helper T-17 cells

潰瘍型結(jié)腸炎（UC）是一種特發(fā)性慢性炎癥，與遺傳、菌群失調(diào)和免疫炎癥損傷等有關(guān)[1-2]。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）功能紊亂在UC發(fā)病中起到重要作用[3-4]，表現(xiàn)為Treg細胞比例下降，白細胞介素（IL）-17水平升高[5]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和IL-10由Treg細胞分泌，可以緩解UC結(jié)腸黏膜的炎癥反應(yīng)[6]。此外，還有許多相關(guān)因子在UC發(fā)病的信號通路中發(fā)揮作用[7-8]。通過調(diào)節(jié)Treg細胞和Th17細胞之間的平衡來治療免疫炎癥性疾病是近年來研究的熱點。蛇葡萄素是從蛇葡萄莖葉中分離的一種多酚羥基雙氫黃酮醇，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[9]。張亞兵等[10]發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素可以改善實驗性結(jié)腸炎大鼠血清和結(jié)腸組織超氧化物歧化酶水平，并減輕結(jié)腸炎性損傷。蛇葡萄素對UC的治療鮮有報道。本研究檢測了蛇葡萄素干預后結(jié)腸炎大鼠相關(guān)因子的表達水平，探討蛇葡萄素對Treg/Th17細胞分化的影響，為蛇葡萄素的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

48只雄性SD大鼠，體重（357.23±21.34）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證編號：11400700325314，許可證號為SCXK（京）2006～2009。動物飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度（22±2）℃、濕度（50±10）%、明暗周期12 h/12 h，自由攝食和飲水。

1.2 實驗分組與處理

采用隨機數(shù)字表法將48只大鼠隨機分為對照組，模型組，高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組，每組8只。除對照組外，其余5組大鼠根據(jù)張亞兵等[10]的模型建立標準，用三硝基苯磺酸（201908213，Sigma）建立實驗性結(jié)腸炎模型。造模成功2 d后，進行藥物治療。高、中、低劑量組大鼠分別灌胃給予500、250、125 mg/（kg·d）蛇葡萄素（張家界至誠生物有限公司，20190211），2次/d[11];柳氮磺吡啶組灌胃柳氮磺吡啶（梯希愛化成發(fā)展有限公司，201509191）100 mg/（kg·d），2次/d;對照組灌胃定量生理鹽水（石家莊四藥有限公司，20190221），2次/d。所有大鼠均干預7 d。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 病理觀察及評分? 取結(jié)腸組織制備石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。顯微鏡（CX43，日本Olympus）下表現(xiàn)進行病理評分[12]，包括：無炎癥現(xiàn)象0分;極少白細胞浸潤1分;少量白細胞浸潤2分;較多白細胞浸潤，結(jié)腸壁增厚3分;結(jié)腸全壁有白細胞浸潤，杯狀細胞丟失，結(jié)腸壁增厚4分。

1.3.2 血漿及結(jié)腸組織相關(guān)蛋白表達水平? 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測血漿中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1，2018102312）、IL-10（ 2018102314）、IL-17（2018102321）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3，2018092234）、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子5（STAT5，20181092252）、維甲酸相關(guān)孤核受體γt（RORγt， 2019021671）、STAT3（2018102332）、IL-35（2018102335）水平及結(jié)腸黏膜組織TGF-β1、IL-10、IL-17、IL-35水平。試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作，ELX 800酶標儀（BioTek公司）檢測。

1.3.3 Western blot檢測大鼠結(jié)腸黏膜Foxp3和STAT5蛋白表達水平? 蛋白提取試劑盒（北京百奧萊博生物科技有限公司，019168）從結(jié)腸黏膜中提取總蛋白，樣品中加入SDS緩沖液煮沸5 min使蛋白變性。經(jīng)凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗，4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ACCESS2全自動化學發(fā)光免疫分析儀（美國Beckman公司）顯色，以β-actin作為內(nèi)參，計算Foxp3和STAT5蛋白條帶的灰度比值。

1.3.4 免疫組化SP法檢測結(jié)腸黏膜RORγt和STAT3蛋白表達水平? 制備結(jié)腸黏膜石蠟切片，二甲苯脫蠟，乙醇脫水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min。將切片在PBS中煮沸30 min，載玻片在5% BSA中培養(yǎng)45 min，4℃下加一抗培養(yǎng)過夜，PBS洗滌3次后加入二抗，37℃下培養(yǎng)45 min。DAB顯色，通過復染、脫水、透明和封片等步驟后在顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及6組病理評分比較

模型組大鼠鏡下可見嚴重上皮損傷，腺體結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細胞浸潤至黏膜下層。蛇葡萄素和柳氮磺吡啶均可改善上皮損傷，減少炎細胞浸潤，保護黏膜肌層，見圖1。模型組病理損傷評分高于對照組（P < 0.05），高、中劑量組和柳氮磺吡啶組病理損傷評分低于模型組（均P < 0.05）。見圖2。

2.2 ELISA試劑盒檢測6組血漿相關(guān)蛋白表達水平比較

模型組TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平低于對照組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組血漿TGF-β1、IL-10、IL-35、Foxp3、STAT5表達水平高于模型組，IL-17、RORγt、STAT3表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。見圖3。

2.3 ELISA試劑盒檢測6組結(jié)腸黏膜相關(guān)蛋白表達水平比較

模型組TGF-β1、IL-10、IL-35表達水平低于對照組，IL-17表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組結(jié)腸黏膜中TGF-β1、IL-10、IL-35蛋白表達水平高于模型組，IL-17表達水平低于模型組（均P < 0.05）。見圖4。

2.4 Western blot檢測6組結(jié)腸黏膜Foxp3和STAT5表達水平比較

模型組Foxp3和STAT5表達水平低于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組Foxp3和STAT5表達水平高于模型組（均P < 0.05）。見圖5。

2.5 免疫組化SP法檢測6組結(jié)腸黏膜RORγt和STAT3表達水平比較

模型組RORγt和STAT3表達水平高于對照組（均P < 0.05）;高、中、低劑量組和柳氮磺吡啶組RORγt和STAT3表達水平低于模型組（均P < 0.05）。見圖6、圖7。

3 討論

Treg細胞功能缺陷和Th17細胞增多是UC免疫炎癥紊亂的重要原因[13-14]。Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路均涉及Treg/Th17分化的調(diào)控[15-16]。在TGF-β1存在的條件下，原始T細胞表面IL-2R與IL-2結(jié)合后激活STAT5，促進Foxp3的轉(zhuǎn)錄，是原始T細胞分化為Terg并分泌IL-10[17-18]。Foxp3是Treg細胞分化所依賴的轉(zhuǎn)錄因子，其表達缺陷可導致腸黏膜發(fā)生嚴重的炎癥損傷[19-20]。與Terg類似的是，IL-6/IL-6R/STAT3信號通路和TGF-β1可誘導Th17細胞分化。STAT3的激活又可促進RORγt表達，其是Th17細胞發(fā)育重要的轉(zhuǎn)錄因子，并且可以促進IL-17的分泌[21-22]。

蛇葡萄素是黃酮類化合物，廣泛存在于藤茶、無刺根等植物，具有抗氧化、抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用[23-24]。既往蛇葡萄素的藥效學研究多集中于腫瘤[25]，而鮮有關(guān)于UC的報道。張亞兵等[10]發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素可以改善實驗性結(jié)腸炎大鼠血清和結(jié)腸組織超氧化物歧化酶水平，并減輕結(jié)腸炎性損傷。本研究首次發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素在改善實驗性結(jié)腸炎大鼠黏膜病理損傷的同時，可以下調(diào)促炎細胞因子的表達。為了證明蛇葡萄素對Treg/Th17細胞分化的影響，本研究檢測了血漿和結(jié)腸黏膜中Terg/Th17細胞相關(guān)分子的蛋白表達水平。研究結(jié)果顯示，高、中、低劑量組血漿TGF-β1、IL-10表達水平高于模型組，IL-17表達水平均低于模型組（均P < 0.05）。為了明確蛇葡萄素對Terg/Th17細胞平衡的影響，本研究檢測了IL-35、Foxp3/STAT5通路和RORγt/STAT3通路的表達情況。研究結(jié)果顯示高、中、低劑量組血漿IL-35表達水平高于模型組（P < 0.05），提示蛇葡萄素可促進Terg/Th17細胞分化。本研究結(jié)果顯示，蛇葡萄素可提高血漿和結(jié)腸組織Foxp3和STAT5表達水平，促進Treg細胞分化;下調(diào)RORγt和STAT3表達，抑制Th17細胞分化，進一步說明蛇葡萄素對Terg/Th17細胞分化有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，蛇葡萄素可以提高實驗性結(jié)腸炎大鼠IL-35表達水平，上調(diào)Foxp3和STAT5表達，下調(diào)RORγt和STAT3表達，進而調(diào)節(jié)Treg細胞和Th17細胞平衡，促進TGF-β1和IL-10分泌，抑制IL-17分泌，增強細胞功能?？偠灾?，蛇葡萄素可能通過調(diào)控Terg/Th17細胞分化而治療UC。

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（收稿日期：2020-04-09）