馮棟梁，封林玉，張倚劍，梁天柱，梁明振

廣西大學動物科學技術(shù)學院，南寧 530004

獸藥抗生素的使用大大降低了畜禽感染疾病的死亡率。隨著畜禽的集約化養(yǎng)殖，抗生素的大量甚至過量且持續(xù)的使用，導致致病性細菌的抗藥性也在穩(wěn)步增加。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國抗生素使用量16.2萬t，獸用抗生素占52%[1]。其中，四環(huán)素類抗生素(TCs)的用量占所有抗生素飼料添加劑的57%[2-3]。有資料顯示，2018年我國生豬養(yǎng)殖量占世界生豬總養(yǎng)殖量的56.6%，遠高于美國等國家以及歐盟。豬糞在畜禽糞污排放量中所占比例最大，占畜禽糞便總量的36.71%[4]。整體而言，國內(nèi)外豬糞中抗生素殘留量呈現(xiàn)以下規(guī)律：四環(huán)素類>氟喹諾酮類>磺胺類>大環(huán)內(nèi)酯類[5]。TCs是從鏈霉菌培養(yǎng)液中提取或半合成的一類抗生素，常見的有金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、四環(huán)素(tetracycline, TC)和多西環(huán)素(doxycycline, DXC)等。它們在豬體內(nèi)不能被完全吸收，一部分在豬組織內(nèi)累積殘留；另一部分隨豬糞排出體外。據(jù)報道，TCs能通過吸附、遷移和降解在土壤、水、植物和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中進行轉(zhuǎn)移，使TCs抗性基因在自然環(huán)境中呈不同程度的分布[6]。

另外，長時間大量使用TCs，不僅使豬腸道產(chǎn)生耐藥細菌，豬糞中抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene, ARGs)增加，還使豬組織中TCs殘留，給生態(tài)平衡和人類健康構(gòu)成威脅[7-11]。近年來，豬糞中抗生素的轉(zhuǎn)歸、降解及生態(tài)學效應(yīng)日益受到關(guān)注。加快豬糞無害化處理和資源化利用，推進豬糞提質(zhì)增效在農(nóng)業(yè)生態(tài)領(lǐng)域已成為一個重要的研究課題。因此，筆者就豬糞堆肥過程中堆體環(huán)境控制、TCs生物轉(zhuǎn)化過程、微生物群落動態(tài)變化和ARGs控制等方面的研究進展進行綜述，旨在為豬糞中TCs的降解及豬糞無害化還田提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 豬糞中TCs的分布現(xiàn)狀及堆肥中理化參數(shù)調(diào)控(Distribution status of TCs in pig manure and regulation of physical and chemical parameters in compost)

1.1 豬糞中TCs的分布現(xiàn)狀

自20世紀50年代美國食品與藥物管理局(FAD)將抗生素用作飼料添加劑以來，在降低動物特別是幼齡畜禽死亡率方面成效顯著，因此，抗生素在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域得到迅速推廣[12]。大部分抗生素屬于廣譜抗菌藥物，長期使用會導致ARGs在一個更大范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移和傳播[13-14]。最新研究表明，人類自身對抗生素的不恰當使用比率為25%，而在動物中此比率則高達50%。TCs作為一種被大量使用的抗生素，當前環(huán)境中的污染源主要來自畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)糞污的排放、農(nóng)藥和醫(yī)院及藥廠廢棄物的處理[15]，而農(nóng)業(yè)土壤中TCs的分布主要源自畜禽糞便的施用[16]。

TCs其化學結(jié)構(gòu)屬于氫化并四苯的衍生物，有4個環(huán)組成，屬于酸堿兩性化合物。其中，TC和OTC都是極性分子，有多種官能團。它們在豬體內(nèi)吸收率低，在環(huán)境中能以不同方式與多種介質(zhì)發(fā)生吸附作用，從而不易被降解[17-19]。常見的TCs分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。TCs在豬體內(nèi)經(jīng)代謝后胃腸道吸收很少，少部分以無活性產(chǎn)物、大部分以母體的形式排出體外，新鮮豬糞中TCs含量高達69%～86%[20-21]。這些隨豬糞排泄進入環(huán)境的TCs，對自然環(huán)境和生物安全具有潛在安全隱患。我國不同地區(qū)豬糞中TCs的種類及檢出率如表1所示。

圖1 常見的四環(huán)素類抗生素(TCs)分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The molecular structures of common tetracycline antibiotics (TCs)

表1 國內(nèi)不同地區(qū)豬糞中檢測到的TCs種類及檢出率Table 1 The detected types and detection rate of TCs in the domestic pig feces from different areas

1.2 豬糞堆肥中理化參數(shù)的調(diào)控

堆肥處理是豬糞中TCs降解的常用方法，而實際生產(chǎn)中，豬糞堆肥中TCs的降解又是一復(fù)雜過程，受多重理化參數(shù)的影響[27]。Mitchell等[28]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥中TCs的降解程度與堆體濕度、溫度、總氮、總磷和C/N等理化參數(shù)間存有很大的相關(guān)性。當豬糞堆體含水率>70%時，堆體孔隙率降低，氧氣透氣量下降，不利于好氧發(fā)酵；當堆體含水率<40%時，好氧微生物的生理活性將會受到影響[29]。常會慶等[30]在不同溫度下對脫水污泥堆肥，發(fā)現(xiàn)堆體環(huán)境溫度對微生物的活性、有害物質(zhì)的降解等具有重要影響，25 ℃比10 ℃更有利于有機質(zhì)降解和污泥堆體的腐熟。相反，Huang等[31]通過定量PCR和16s RNA高通量測序發(fā)現(xiàn)，高溫條件下豬糞中適度的抗生素殘留，對豬糞微生物可產(chǎn)生短暫的抑制作用，但是在堆糞過程中如果不能有效地抑制病原體和抗性基因轉(zhuǎn)移，高溫并不一定能更好地去除糞中抗生素的ARGs。此外，儲意軒等[32]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在堆肥過程中，糞中微生物代謝有機酸的產(chǎn)生或揮發(fā)、有機氮的分解和氨氣的釋放均可使堆體pH發(fā)生變化，對豬糞中TCs的降解產(chǎn)生不同程度的影響。有研究表明，豬糞堆肥中添加不同比例的生物炭，可使堆體提前3 d進入高溫期，堆體生物炭總氮含量增加。高溫條件下，當堆體中C/N含量降低時，豬糞中的氮會以氨氣的形式揮發(fā)；當堆體C/N超過35時，糞中微生物需進行多次代謝循環(huán)，導致降解速度下降[33-34]。周思等[35]在豬糞中添加鋸末和秸桿調(diào)控豬糞中C/N時，發(fā)現(xiàn)初始C/N為(23～27)∶1時，堆肥效果最好。因此，豬糞堆肥中理化參數(shù)的調(diào)控對豬糞中抗生素的降解至關(guān)重要。豬糞堆肥過程中堆體常見的理化參數(shù)控制值如表2所示。

2 豬糞中ARGs的水平傳播(Horizontal transmission of ARGs in pig manure)

豬糞不經(jīng)堆肥處理直接作為有機肥在農(nóng)田中使用，給豬糞中抗生素ARGs的傳播、后續(xù)環(huán)境中重金屬含量的增加埋下了潛在的風險[46-47]。豬糞作為TCs的有機載體，含有多種病原微生物和營養(yǎng)養(yǎng)分，也是四環(huán)素類抗生素ARGs重要的富集位點。TCs的污染及ARGs水平轉(zhuǎn)移對致病菌耐藥性的快速傳播起著重要作用?？股剡M入環(huán)境后，會發(fā)生吸附、水解、光解和微生物降解等過程，將直接影響抗生素的生態(tài)毒性[48]。Huang等[49]研究發(fā)現(xiàn)，雨季時，畜牧區(qū)地表水和地下水中存在嚴重的ARGs污染，可能會構(gòu)成生態(tài)風險并引發(fā)食品安全問題。其次，豬糞中ARGs不僅可借助細菌的特異性同源重組，還可通過基因傳播元件(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列和基因組島)等實現(xiàn)菌種間的水平轉(zhuǎn)移[50-51]。同時，TCs是疏水性有機物，可與碳基材料、納米材料、高分子聚合材料、分子印跡材料和礦物質(zhì)等諸多物質(zhì)發(fā)生吸附作用[52-54]。樓晨露[55]對我國4個長期施用豬糞和不施用豬糞的定位試驗點的表層和剖面土壤進行采樣，發(fā)現(xiàn)TCs在長期施用豬糞稻田土壤表層有累積效應(yīng)。與不施用豬糞的土壤相比，施用豬糞的土壤ARGs豐度明顯提高，TCs污染可從表層土壤向深層土壤遷移。Guo等[56]通過色譜質(zhì)譜及實時定量PCR這2種方法抽檢長期施用有機肥的表層土壤，發(fā)現(xiàn)土壤中存有鋅、銅重金屬污染，且ARGs含量顯著增加。當前受堆肥原料及環(huán)境條件的限制，豬糞還不能達到無害化利用的要求。分析豬糞中TCs的來源及ARGs傳播途徑，是減少豬糞中TCs的重要方法。豬糞中TCs的來源及其潛在的轉(zhuǎn)移途徑如圖2所示。

3 豬糞中TCs的生物轉(zhuǎn)化(Biotransformation of TCs in pig manure)

3.1 豬糞堆肥中微生物與TCs的相互作用

微生物降解是豬糞中TCs削減的一種重要方式，同時堆肥過程中微生物群落的變化也是豬糞中TCs抗性基因變異的主要驅(qū)動因素。張凱煜[57]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥過程中TCs能改變豬糞中細菌、真菌的多樣性，使升溫期內(nèi)微生物的活性增加，TCs的降解加速。時紅蕾[58]研究發(fā)現(xiàn)，隨著豬糞堆肥中TCs濃度的增加、堆體溫度的改變，糞中微生物的代謝活性將受到抑制，微生物群落的多樣性指數(shù)逐漸下降。馬駿[59]利用添加TCs的豬糞和小麥秸稈進行堆肥，發(fā)現(xiàn)豬糞中微生物的活性和碳源呈先下降后升高的趨勢，TCs的降解率達97.9%。可見，豬糞堆肥中微生物與抗生素可產(chǎn)生互作效應(yīng)，對糞中微生物的代謝、抗生素的削減可產(chǎn)生不同程度的影響。

3.2 豬糞堆肥中四環(huán)素類抗生素ARGs的降解

豬糞中殘留的抗生素進入環(huán)境后可產(chǎn)生ARGs，ARGs可通過豬糞轉(zhuǎn)移，水平傳播。王曉慧等[60]對不同階段的豬糞進行堆肥，發(fā)現(xiàn)豬糞中四環(huán)素類抗生素ARGs檢出率大小順序依次為成年豬糞>幼豬糞>堆肥豬糞>土壤。李海超[61]在堆料中添加不同比例的生物炭，發(fā)現(xiàn)生物炭對四環(huán)素類抗生素ARGs中的tetC、tetG、tetW和tetX豐度有顯著影響。Kang等[62]研究發(fā)現(xiàn)，豬糞經(jīng)過4 d的短期高溫堆肥處理，豬糞中四環(huán)素類抗生素ARGs不能被完全去除，但短暫的高溫對豬糞中殘留的四環(huán)素類抗生素ARGs在土壤中的積累和擴散具有控制作用。Zhang等[63]在堆料中加入木屑、稻殼和蘑菇殘渣，在同溫條件下進行堆肥試驗，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)能通過改變微生物菌群，增強抗生素和ARGs去除的潛力，其去除率為14.9%～33.4%。也有研究表明，豬糞在堆肥過程中，糞中的磺胺類藥物也會對糞中TCs及相關(guān)ARGs的降解產(chǎn)生影響[64]。Mao等[65]用竹炭和2種菌粉加入豬糞進行堆肥實驗，發(fā)現(xiàn)溫度和有機碳含量可對細菌降解TCs產(chǎn)生影響?？梢?，堆肥可在很大程度上降低糞肥中四環(huán)素類抗生素ARGs。糞中優(yōu)勢菌群的篩選、最適溫度調(diào)控和外來環(huán)境因子的影響對抗生素的降解也非常關(guān)鍵。

圖2 豬糞中TCs的來源及其潛在的轉(zhuǎn)移途徑Fig. 2 Sources of TCs in pig manure and their potential transfer pathways

表2 常見豬糞堆肥時的理化參數(shù)控制值Table 2 The values of physical and chemical parameters in common pig manure composting

3.3 豬糞堆肥中微生物菌群的變化

豬糞堆肥中抗生素削減的同時，伴隨著微生物的變化。而微生物不僅是ARGs的攜帶者，也是糞中抗生素降解的參與者。據(jù)報道，豬糞堆肥中微生物菌群對堆肥過程中溫度的調(diào)控起主導作用，豬糞中微生物及其產(chǎn)生的酶也是有機物降解的關(guān)鍵[66]。黃雅楠等[67]研究發(fā)現(xiàn)，豬糞堆肥過程中微生物與理化因子相互作用，優(yōu)勢菌梭菌屬菌豐度從最初的6.94%增加至高溫階段的18.56%，腐熟期后降低至0.62%。曹云等[68]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥前期微生物數(shù)量變化趨勢基本相同，嗜溫菌豐度呈現(xiàn)先升高后下降，嗜熱菌豐度隨堆肥溫度逐漸上升；同時，嗜熱性纖維分解菌對堆體持續(xù)高溫、加速有機質(zhì)降解有促進作用。張海濱等[69]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥中微生物種類繁多，不同的堆肥原料可產(chǎn)生菌群差異。堆體纖維素的降解速度直接影響腐熟進程，優(yōu)勢菌可減少堆肥中的氮素流失。肖禮等[39]在豬糞中添加白腐真菌及其混合外源菌劑，單一白腐真菌處理下的豬糞中銨態(tài)氮的降解最小；四環(huán)素和土霉素的含量隨堆肥時間顯著下降，經(jīng)過42 d后2種抗生素降解率可達90%以上(OTC、TC濃度<5 mg·kg-1)。可見，豬糞堆肥中微生物菌群的變化可影響豬糞中抗生素的削減。

4 豬糞堆肥中TCs的降解(Degradation of TCs in pig manure compost)

4.1 堆肥方式對TCs降解的影響

畜禽污染已成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來源和重要成因?？股匾坏┙?jīng)豬體代謝進入環(huán)境后，便會隨土壤、水和沉積物重新分布。目前，畜禽糞污處理和資源化利用主要有3種模式：能源化利用、肥料資源化利用和工業(yè)化處理。當前農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、豬糞集中排放和規(guī)模化處理已逐漸成為一種趨勢[70]。四環(huán)素類抗生素在生物轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生代謝及降解產(chǎn)物，與母體相比，雖然活性降低，但毒性卻增強[71]。Winckler和Grafe[72]給豬口服四環(huán)素5 d，定期收集排泄物，發(fā)現(xiàn)實驗結(jié)束2 d后的排泄物中，含72%四環(huán)素的活性成分。鹽酸四環(huán)素在豬糞中表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，半衰期在55～105 d之間。豬糞堆肥化處理中，主要有好氧堆肥和厭氧堆肥，好氧堆肥是當前較為常見的技術(shù)，堆肥效果也更好[73]。研究表明，不同堆肥方式對TCs的降解去除效果可產(chǎn)生不同程度的影響(表3)。

表3 不同堆肥方式對豬糞中TCs的降解效果Table 3 Degradation of TCs in pig manure by different composting methods

4.2 堆肥中TCs的生物降解

豬糞中TCs的生物降解主要依賴于糞中微生物的活動。豬糞中抗生素的結(jié)構(gòu)和藥理學作用在微生物的作用下可發(fā)生一系列復(fù)雜的改變，不僅會產(chǎn)生有毒次生代謝產(chǎn)物，還有碳水化合物[79]。豬糞堆肥中TCs的高效降解，優(yōu)勢耐藥細菌菌株在其中發(fā)揮了很大的作用。成潔等[80]在畜禽糞便池底部采集樣品，進行平板涂布實驗，得到木糖氧化無色桿菌對CTC、TC和OTC的降解率分別為65.5%、63.9%和58.3%。吳學玲等[81]從豬場糞便沉積池污泥中分離出的拉烏爾菌屬的菌株，在代謝過程中能產(chǎn)生表面活性劑，可對TCs進行高效降解，降解率>70.68%。其次，Liu等[82]采用無土栽培技術(shù)，發(fā)現(xiàn)生姜生長能削減環(huán)境中的TCs，其中生姜中根、莖根、莖和葉TCs殘留量依次為：28.1、15.3、2.4和0.9 mg·kg-1。因此，豬糞中降解TCs的微生物來自多個方面，經(jīng)過生物降解能在佷大程度上降低豬糞中TCs的比例，促進堆肥腐化進程，提高堆肥產(chǎn)品養(yǎng)分含量和堆肥品質(zhì)。

4.3 堆肥中TCs的非生物降解

TCs在堆肥中可發(fā)生不同的吸附過程，且可在光、水及與化學物質(zhì)作用中發(fā)生非生物降解。王攀攀等[83]對豬糞沼液中TCs進行光降解處理，發(fā)現(xiàn)不同波長光源中TCs的降解效果為：高壓汞燈>紫外消毒燈>長弧氙燈>無光。用高壓汞燈照射2 h后，糞中TC、OTC和CTC的降解率可達91.68%、85.58%和81.18%。Wu等[84]研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥過程中添加酸性磷酸鹽，可控制氮損失和抑制有機物轉(zhuǎn)化，因此，預(yù)期會優(yōu)化堆肥效果。生物炭是一種良好的土壤改良劑，具有較強的氧化還原活性，對環(huán)境中的污染物有很好的吸附作用。Wang等[85]研究發(fā)現(xiàn)，稻草生物炭的吸附能力高于豬糞生物炭，且隨著熱解溫度的升高而增大。另外，生物炭在好氧堆肥過程中能提高堆體溫度，激活纖維素酶、脲酶活性，降低抗性基因tetC、tetG、tetW和tetX豐度[20]。臭氧氧化也是一種降解TCs的有效方法。Khan等[86]發(fā)現(xiàn)TCs經(jīng)臭氧氧化4～6 min后水溶液中TCs可完全去除。其中，臭氧可對TCs雙鍵、芳香環(huán)和氨基進行修飾，使產(chǎn)物的m/z值發(fā)生變化。自由基可與TC的臭氧化產(chǎn)物發(fā)生非選擇性反應(yīng)。豬糞堆肥中TCs的非生物降解，也是促使豬糞中TCs降解的一種方法。

5 結(jié)論與展望(Conclusion and prospect)

近年來，畜禽糞便堆肥化處理已逐漸成為一種趨勢。在高濃度抗生素抗性選擇壓力條件下，豬糞妥善處理、抗生素的高效降解顯得尤為重要。如今養(yǎng)豬生產(chǎn)上用藥名錄繁多，且糞尿干濕、雨污未能有效分流，這給豬糞堆肥處理增加了難度?；诮陙碡i糞堆肥最新的研究進展，對當前我國豬糞堆肥中存在的突出問題，可在以下幾個方面尋找突破：(1)豬糞中TCs的降解是個動態(tài)過程，主導TCs降解的微生物在堆肥中起很大作用，能抑制四環(huán)素類抗生素ARGs的水平轉(zhuǎn)移和擴散。因此，在豬糞堆肥過程中篩選TCs降解的優(yōu)異菌株，同時堆肥中結(jié)合生物與非生物降解技術(shù)，可進一步提高豬糞堆肥中TCs的降解效果。(2)豬糞堆肥后，豬糞中殘留的抗生素尚不能得到全部降解，殘留的四環(huán)素類抗生素代謝的中間產(chǎn)物和微生物有毒代謝產(chǎn)物需得到進一步降解，才能實現(xiàn)糞肥在土壤中的無害化利用。(3)我國每年養(yǎng)豬生產(chǎn)上抗生素的用量和種類不斷變化。對豬群不同飼養(yǎng)階段飼用抗生素的用量及豬群TCs的代謝情況進行調(diào)查，探究豬糞便、污水及土壤中TCs的生態(tài)毒性，指導豬糞堆肥效果的進一步優(yōu)化。

◆