酸性硅膠柱凈化-氣相色譜法測定禽肉中8種多溴聯(lián)苯醚污染物含量

馬仕豪，饒欽雄，張其才，王獻(xiàn)禮，趙志輝，宋衛(wèi)國*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

【研究意義】多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是溴代阻燃劑（brominated flame re?tardants，BFRs）的一種，常作為一種添加型阻燃劑被廣泛地應(yīng)用在電子、化工、建材、紡織、石油、采礦等領(lǐng)域[1]。目前商用的PBDEs 主要有五溴聯(lián)苯醚、八溴聯(lián)苯醚和十溴聯(lián)苯醚，2001 年的全球需求量分別為7 500，3 790 和56 100 t[2-5]，十溴聯(lián)苯醚（BDE-209）是目前世界上使用量最大的阻燃劑品種之一。如此大的使用量使得PBDEs 及代謝產(chǎn)物在多種環(huán)境介質(zhì)中，如大氣、土壤、水等環(huán)境介質(zhì)及動植物體中均檢出PBDEs，其中BDE-209 含量最高、分布最廣，BDE-209 不僅具有內(nèi)分泌毒性、免疫毒性以及肝臟毒性等，而且在環(huán)境或生物體內(nèi)發(fā)生脫溴反應(yīng)或轉(zhuǎn)化生成毒性更高的BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183 等低溴代PBDEs 以及3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE-47、6-MeO-BDE-47 等甲氧基多溴聯(lián)苯醚，其通過食物鏈逐級放大，最后進(jìn)入人體從而威脅到人類的健康[6-15]。2009 年5 月，《斯德哥爾摩公約》第4 次締約方大會已將五溴聯(lián)苯醚和八溴聯(lián)苯醚列為新型持久性有機(jī)污染物［16］。BDE -209 目前雖未列入持久性有機(jī)污染物，但由于其可脫溴或轉(zhuǎn)化為更毒化合物，其潛在的風(fēng)險不可忽視，本文即以BDE-209 及其相關(guān)的降解產(chǎn)物為目標(biāo)，研究建立PBDEs 在禽肉中的殘留檢測技術(shù)以應(yīng)對風(fēng)險評估研究的需求?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國際上檢測PBDEs 的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是參考美國環(huán)保局（EPA）方法EPA 1614，該方法與EPA 1613 中二噁英的檢測方法相似，利用多個層析柱進(jìn)行凈化處理。國內(nèi)大部分學(xué)者多采用氣相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行PBDEs 檢測技術(shù)的研究[17-26]。李敏杰［17］利用凝膠滲透色譜（GPC）和固相萃取柱進(jìn)行凈化建立了GC-MS 檢測雞蛋中PBDEs 的方法；王景鑫［18］先以濃硫酸除脂凈化再用GPC 進(jìn)行2 次凈化處理GC-MS 檢測雞飼料樣品；沈夢楠[22]分析典型溴代阻燃劑（BDE-47）在鯽魚體內(nèi)與體外代謝時采用GPC 和硅膠柱凈化。【本研究切入點】高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜儀（HRGC-HRMS）檢測，方法凈化過程繁瑣，分析儀器昂貴，實驗室條件要求高，一般實驗室不具備該檢測條件，不適宜廣泛推廣應(yīng)用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文采用快速溶劑萃取法提取，結(jié)合濃硫酸和固相萃取柱凈化的優(yōu)點，制備酸性硅膠柱創(chuàng)新性的用于PBDEs 的凈化，GC-ECD 檢測，該方法更為經(jīng)濟(jì)和高效，適用于大量禽肉樣品中PBDEs 的篩查。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑

儀器：高速粉碎機(jī)FW80（中國天津泰斯特儀器有限公司）；快速溶劑萃取儀ASE-300（美國戴安公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-300（瑞士Buchi）；渦旋混合器MX-S（中國東邁科技儀器有限公司）；氮吹儀NEVAP-112（美國Organomation）；氣相色譜儀6890N（美國安捷倫公司），配電子捕獲檢測器（ECD）；破壁料理機(jī)JYL-C022E（中國九陽股份有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)Pilot2-4LD（中國北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

試劑：正己烷、壬烷、二氯甲烷均為農(nóng)殘級，購于迪馬科技有限公司；丙酮為農(nóng)殘級購自于上海安譜實驗科技有限公司；硅膠（75～250μm）購于上海懷聰生物科技有限公司。

PBDEs標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括2，2’，4，4’-四溴二苯醚（BDE-47，CAS：5436-43-1，50.0 mg/L；2，2’，4，4’，5-五溴二苯醚（BDE-99，CAS：60348-60-9，50.0 mg/L）；2，2’，4，4’，5，5’-六溴二苯醚（BDE-153，CAS：68631-49-2，50.0 mg/L）；2，2’，3，4’，4，5’，6’-七溴二苯醚（BDE-183，CAS：207122-16-5，50.0 mg/L）；十溴二苯醚（BDE-209，CAS：1163-19-5，50.0 mg/L）；3-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（3-MeO-BDE-47，CAS：N/A，50.0 mg/L）；5-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（5-MeO-BDE-47，CAS：N/A，50.0 mg/L）；6-甲氧基-2，2’，4，4’-四溴二苯醚（6-MeO-BDE-47，CAS：N/A，10.0 mg/L）均購自美國AccuStandard公司?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液：將8種PBDEs的標(biāo)準(zhǔn)溶液用壬烷逐級稀釋混合配制成1 mg/L的8種PBDEs的標(biāo)準(zhǔn)工作液并保存于-20oC冰箱內(nèi)，有效期6個月。

酸性硅膠柱的制備：取一定量100 目～200 目事先經(jīng)550oC 活化12 h并干燥保存的活性硅膠，將濃硫酸按照與硅膠質(zhì)量比為11∶14 和3∶7 的比例逐滴與硅膠充分混合并振蕩，直至獲得均勻的混合物，分別制得44%酸性硅膠和30%酸性硅膠；取一定量無水硫酸鈉660oC 干燥不少于6 h 保存；于內(nèi)徑為15 mm的層析柱，依次裝入1 g活性硅膠、10 g 44%酸性硅膠、2 g 30%酸性硅膠、2 g活性硅膠和6 g無水硫酸鈉，干法裝柱。

1.2 方法

1.2.1 試樣制備 禽肉樣品用破壁料理機(jī)攪拌成漿狀，置于真空冷凍干燥機(jī)中于-20oC、真空度為1 Pa條件下冷凍干燥72 h，再用高速粉碎機(jī)將樣品打碎成粉末，置于-20oC冰箱中保存。

1.2.2 提取 準(zhǔn)確稱取5.0 g試樣于燒杯中，與10.0 g無水硫酸鈉混合均勻，轉(zhuǎn)移至加速溶劑萃取池中進(jìn)行提取。提取條件為萃取溶劑，正己烷∶二氯甲烷=1∶1（v/v）；壓力，10.3 MPa（1 500 psi）；溫度，100oC；加熱時間，5 min；靜態(tài)提取時間，8 min；吹掃時間120 s循環(huán)3次。樣品提取液轉(zhuǎn)移至平底燒瓶中，用少量正己烷分3次清洗接收瓶，并將提取液旋蒸濃縮至近干，加5 mL正己烷復(fù)溶，待凈化。

1.2.3 凈化 用30 mL 正己烷預(yù)淋洗酸性硅膠柱后，將待凈化液加入柱中，并用3 mL 正己烷清洗3 次，清洗液一并加入柱中，當(dāng)液面接近凈化柱最上層，再用80 mL 正己烷∶二氯甲烷=1∶1（v/v）對酸性硅膠柱進(jìn)行洗脫，收集上樣液和洗脫液，旋蒸濃縮至3～5 mL轉(zhuǎn)移至試管，3 mL正己烷清洗3次，氮氣吹干，200μL壬烷復(fù)溶待測。

1.2.4 氣相色譜條件 色譜柱：HP-5（30 m×320μm×0.25μm）。升溫程序：初始柱溫140 ℃，保持2 min；再以25 ℃/min 升至180 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min 升至260 ℃，保持5 min；最后以15 ℃/min 升至310 ℃，保持10 min。載氣為高純氮氣，流速為2 mL/min；檢測器300 ℃；進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度：265 ℃。進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

圖1 優(yōu)化升溫程序前的色譜Fig.1 Chromatogram before optimizing the heating program

本研究初始?xì)庀鄺l件參考由宗政等[23]的研究條件，初始柱溫140oC，保持1min；再以10 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升至260 ℃，保持2 min；最后以25 ℃/min升至310 ℃，保持10 min，結(jié)果5-MeO-BDE47 和6-MeO-BDE-47 沒有有效分離，見圖1，這是由于化合物性質(zhì)相似，出峰時間相近造成的。然而8 種PBDEs 的沸點為310～425 ℃，由于BDE-209 的沸點較低，高溫下易降解，因此進(jìn)樣口溫度設(shè)置為265 ℃，最高柱溫設(shè)置為310 ℃，這樣既可以防止PBDEs 在進(jìn)樣口處的分解，又可以防止其在色譜柱內(nèi)的分解。最后本研究通過調(diào)整升溫程序，最后在1.2.4 的氣相色譜條件下，8 種多溴聯(lián)苯醚均獲得了有效的分離，并獲得較好的儀器相應(yīng)值，但是BDE-209 的響應(yīng)值較其他化合物依然要低很多，詳見圖2。

圖2 優(yōu)化升溫程序后的色譜Fig.2 Chromatogram after optimizing the heating program

2.2 酸性硅膠柱洗脫條件優(yōu)化

在PBDEs的檢測方法中，生物樣品中的大量油脂和雜質(zhì)主要是通過濃硫酸、GPC和固相萃取柱來去除。樣品中直接添加濃硫酸，除脂能力最強(qiáng)，但其可能會引起化合物的不穩(wěn)定，且操作較為危險；GPC 除脂效果顯著，但是除脂能力有限，普通凈化柱只能去除0.5 g左右脂肪，超過這個脂肪量則會引起柱堵塞；固相萃取小柱重現(xiàn)性好且適合批量生產(chǎn)，但是普通規(guī)格的小柱除脂能力較難達(dá)到本研究的要求。因此本文結(jié)合濃硫酸和固相萃取柱的優(yōu)點，參考EPA 1614的復(fù)合硅膠柱的制作方法，制成酸性硅膠柱，為達(dá)到最佳的凈化效果，本文對酸性硅膠柱的洗脫條件進(jìn)行了摸索。

圖3 8 種PBDEs的洗脫結(jié)果Fig.3 Elution results of eight PBDEs

以標(biāo)準(zhǔn)品配制含100 μg/L 的8 種多溴聯(lián)苯醚的提取液上凈化柱，選用正己烷和正己烷∶二氯甲烷（1∶1，v/v）作為洗脫溶劑，分段收集洗脫液，每段收集20 mL，測定洗脫液，結(jié)果見圖3。

結(jié)果采用正己烷洗脫時，80 mL 能將BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183 基本洗脫下來，但MeO-BDE 由于極性較弱無法洗脫，而以以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作為洗脫溶劑，60 mL 能夠基本洗脫，80 mL 可以完全洗脫，因此本研究確定以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作為方法的洗脫溶劑，洗脫體積為80 mL。

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

移取1 mg/L 的PBDEs 混合標(biāo)液，壬烷逐級稀釋，配制質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，20，50，100，200，500 μg/L 的PBDEs 標(biāo)準(zhǔn)工作液，氣相色譜進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，以橫坐標(biāo)作為質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)作為響應(yīng)峰面積，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，8種PBDEs具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

采用優(yōu)化的前處理方法和儀器條件，進(jìn)行一系列低水平加標(biāo)回收試驗，以3 倍和10 倍信噪比（S/N）來確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果，BDE-209 的檢出限（LOD）為0.125μg/kg 其余7 種PBDEs 的檢出限為0.025 μg/kg；BDE-209 的定量限（LOQ）為0.4 μg/kg 其余7 種PBDEs 的定量限為0.1 μg/kg。目前國內(nèi)外尚未規(guī)定食品中PBDEs 的限量標(biāo)準(zhǔn)，但EPA 規(guī)定商用十溴聯(lián)苯醚每日可攝入計量為10μg/kg；商用八溴聯(lián)苯醚每日可攝入計量為3μg/kg；商用五溴聯(lián)苯醚每日可攝入計量為2μg/kg，按照可攝入量計量要求，本方法的檢出限應(yīng)能滿足PBDEs 的檢測要求。且與一些相關(guān)的研究報道相比較，例如李敏潔[17]檢測雞蛋中的BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183、6-MeO-BDE-47 檢出限為0.02～0.05μg/kg；王景鑫[18]建立了飼料中檢測BDE-47 的方法，檢出限為0.11 μg/kg；王旭亮[21]建立了豬肝中的檢測方法BDE-47 的檢出限為0.081 μg/kg，BDE-153 的方法檢出限為0.110 μg/kg；沈夢楠[22]建立了鯽魚內(nèi)檢測BDE-47 的方法檢出限為0.25μg/kg。本方法的靈敏度與報道的方法相當(dāng)，但本方法只需要通過酸性硅膠柱凈化濃縮后即可上機(jī)檢測，更加的簡單實用。

表1 8種PBDEs的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、方法檢出限和定量限Tab.1 Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，and method detection limits of 8 PBDEs

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

以空白雞肉樣品為代表進(jìn)行添加回收實驗，設(shè)置方法定量限以及1.0μg/kg 和10.0μg/kg 3 個水平，每個水平重復(fù)5次，同時設(shè)置空白對照，按照本研究建立的前處理方法和儀器方法進(jìn)行檢測，用基質(zhì)標(biāo)定量，計算回收率和精密度（RSD）。添加回收結(jié)果見表2。

從表2中可以看出8種PBDEs在雞肉中的平均加標(biāo)回收率為66.0%～146.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～11.4%。本方法的準(zhǔn)確度滿足EPA1614[27]方法中PBDEs 的回收率為50%～150%的要求，方法的精密度也滿足GB/T 27404的要求，證實該方法可以滿足禽肉中8種PBDEs的定量檢測要求。

表2 雞肉中8種PBDEs的平均加標(biāo)回收率和精密度Tab.2 The average recoveries and RSDs of 8 PBDEs in chicken

3 結(jié)論與討論

本文通過對儀器條件和前處理凈化條件的研究，建立了禽肉中8種多溴聯(lián)苯醚的氣相色譜定量檢測方法。加標(biāo)回收實驗表明本方法的檢出限為0.025～0.125μg/kg，定量限為0.1～0.4μg/kg，方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足殘留檢測的要求。目前國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行了PBDEs 的研究，李敏杰[17]、王景鑫[18]、王旭亮[21]、沈夢楠[22]等學(xué)者分別建立了雞蛋、飼料魚肉、豬肝中PBDEs 的前處理技術(shù)，采用GPC 凈化后結(jié)合固相萃取柱等方法凈化，但GPC 只能處理單個樣品，因此效率較低，且消耗試劑量較大。本研究對前處理進(jìn)行了創(chuàng)新改進(jìn)，參考EPA 1614 的復(fù)合硅膠柱的制作方法，制成酸性硅膠柱，為達(dá)到最佳的凈化效果，確定以正己烷∶二氯甲烷（1∶1）作為洗脫溶劑，洗脫體積為80 mL。本研究僅用酸性硅膠柱凈化濃縮即可分析檢測，同時處理多個樣品，方法效率高且環(huán)保。本實驗采用許多分析實驗室均有的氣相色譜儀進(jìn)行定量檢測，使得方法更具有適用性，克服了高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜儀（HRGC-HRMS）方法凈化過程繁瑣、分析儀器昂貴的缺點，為多溴聯(lián)苯醚研究提供了更為實用的檢測手段，適合于大批量禽肉樣品中PBDEs 的篩查和相對高含量樣本的檢測。然而本實驗僅研究了禽肉樣品中PBDEs 的檢測方法，對于其它非禽肉樣品中PBDEs的分析檢測仍需要進(jìn)一步的研究。

致謝：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院宋衛(wèi)國和饒欽雄老師以及持久性有機(jī)污染物研究科室的工作人員在試驗和文章上提出了寶貴意見，謹(jǐn)致謝意！