程燕 何啟勝

池州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 247000

微小RNA(miRNA)是不編碼蛋白質(zhì)的RNA。人血液中的miRNA非常穩(wěn)定，對內(nèi)源性RNA酶不敏感[1]。從腫瘤細胞釋放到體液的miRNA及其細胞內(nèi)miRNA是診斷癌癥的潛在生物標(biāo)志物。最近的研究分析了不同類型甲狀腺腫瘤組織中miRNA的表達，結(jié)果表明，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者血清miR-451a、miR-25-3p、生長阻滯特異性因子8反義RNA 1(the growth arrest-specific 8-antisense RNA 1,GAS8-AS1)的表達與非腫瘤組織或良性增生性多結(jié)節(jié)性甲狀腺組織有顯著差異[2-3]。目前臨床常用甲狀腺球蛋白(Tg)作為甲狀腺癌血液指標(biāo)的參考。故本研究以Tg作為參考，探討血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1聯(lián)合檢測對早期PTC診斷的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2016年3月至2019年3月池州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的早期PTC患者70例為腫瘤組；其中男33例，女37例，年齡33～72歲，平均年齡(46.13±12.09)歲；腫瘤直徑1.1～3.5 cm，平均直徑為(1.89±0.92)cm；依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟《TNM惡性腫瘤分類》第7版進行TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期22例。同時納入池州市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科院收治的甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者70例為良性組；其中，男34例，女36例，年齡31～82歲，平均年齡(43.50±18.38)歲。腫瘤組和良性組均經(jīng)池州市人民醫(yī)院病理科證實。排除標(biāo)準：(1)嚴重心、肝、腎功能損害者。(2)長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者。(3)患有精神疾病者。(4)患有其他腫瘤者。同時，納入2016年3月至2019年3月于池州市人民醫(yī)院體檢的健康體檢者70名為對照組；其中男35名，女35名，年齡39～77歲，平均年齡(45.28±16.28)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，可納入此次分析。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批(IEC-FOM-013-20)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法 采集治療前腫瘤組、治療前良性組和對照組的肘前靜脈血5 ml。使用武漢艾美捷科技有限公司的Tg檢測試劑盒(貨號：KA4022)。

使用RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP5301)抽取總RNA。miR-451a、 miR-25-3p、 GAS8-AS1的引物通過NCBI在線設(shè)計，見表1，交由武漢金凱瑞公司合成。以U48作為內(nèi)參。3個指標(biāo)為同一批樣本分批檢測，去除極大值和極小值，保留其余數(shù)據(jù)。

表1 引物序列和名稱

2 結(jié)果

2.1 3組血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1、Tg的表達水平 腫瘤組、良性組和對照組血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1、Tg的表達水平差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

2.2 腫瘤組和對照組血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的ROC曲線、AUC、敏感性、特異性和截斷值 為了評估血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1在腫瘤組和對照組中的診斷價值，繪制腫瘤組和對照組的ROC曲線。miR-451a的ROC曲線AUC為0.89±0.05(95%CI: 0.804 7～0.988 7，P<0.000 1)，以miR-451a的陽性臨界值為0.330 4，其診斷敏感性為86%，特異性為93%；GAS8-AS1的ROC曲線AUC為0.84±0.05(95%CI: 0.734 6～0.947 6，P<0.000 1)，以GAS8-AS1的陽性臨界值為0.712 3，其診斷敏感性為83%，特異性為83%；miR-25-3p的ROC曲線AUC為0.84±0.06(95%CI： 0.737 3～0.958 2，P<0.000 1)，以miR-25-3p的陽性臨界值為0.908 9，其診斷敏感性為87%，特異性為87%。Tg的ROC曲線AUC為0.81±0.04(95%CI： 0.728 3～0.882 8，P<0.000 1)，以Tg的陽性臨界值為12.87(μg/L)，其診斷敏感性為83%，特異性為73%，見圖1(封3)。

表2 3組血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1的表達水平比較

2.3 腫瘤組和良性組血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的ROC曲線、AUC、敏感性、特異性和截斷值 為了評估血清中miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1在腫瘤組和對照組中的診斷價值，繪制腫瘤組和對照組的ROC曲線。miR-451a的ROC曲線AUC為0.85±0.06(95%CI: 0.736 5～0.974 6，P<0.000 1)，以miR-451a的陽性臨界值為1.029，其診斷敏感性為97%，特異性為87%；GAS8-AS1的ROC的AUC為0.86±0.06(95%CI: 0.75～0.97，P<0.000 1)，以GAS8-AS1的陽性臨界值為0.713 5，其診斷敏感性為97%，特異性為80%；miR-25-3p的ROC曲線AUC為0.84±0.05(95%CI：0.748 5～0.947 0，P<0.000 1)，以miR-25-3p的陽性臨界值為1.046，其診斷敏感性為78%，特異性為93%。Tg的ROC曲線AUC為0.81±0.04(95%CI： 0.729 7～0.886 0，P<0.000 1)，以Tg的陽性臨界值為12.54(μg/L)，其診斷敏感性為84%，特異性為71%，見圖2(封3)、表4。

2.4 血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1聯(lián)合診斷早期PTC 患有早期PTC為真陽性，未患有早期PTC為真陰性。因Tg的敏感性和特異性較低，故采用血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的聯(lián)合診斷。以miR-451a的陽性臨界值為1.029，GAS8-AS1的陽性臨界值為0.723， miR-25-3p的陽性臨界值為1.046為診斷標(biāo)準，三者均滿足為聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1聯(lián)合對早期PTC診斷的敏感性為94.29%(66/70)，特異性為88.57%(124/140)，準確性為90.48%(190/210)，見表3。

表3 血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1聯(lián)合診斷早期甲狀腺乳頭狀癌

3 討論

目前，患有可疑甲狀腺結(jié)節(jié)的患者通常通過超聲、CT進行檢查。隨后，通過術(shù)前超聲引導(dǎo)細針穿刺細胞學(xué)檢查和術(shù)中病理檢查冷凍切片檢查可疑PTC患者[4]。術(shù)前超聲引導(dǎo)細針穿刺細胞學(xué)檢查采樣不足會導(dǎo)致細胞學(xué)診斷失敗，可能需要反復(fù)抽吸[5]。由于其侵入性，重復(fù)抽吸對PTC患者可能是危險的。迫切需要一種新的生物標(biāo)志物來區(qū)分臨床上的惡性甲狀腺病變和良性甲狀腺病變。本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-451a、 miR-25-3p、 GAS8-AS1聯(lián)合對早期PTC診斷的敏感性為94.29%，特異性為88.57%，準確性為90.48%。血清miR-451a、 miR-25-3p、GAS8-AS1單項診斷的敏感性和特異性均高于Tg。

以往的研究表明，甲狀腺組織中miR-451表達上調(diào)與PTC淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，而甲狀腺未分化癌細胞中miR-25的異位表達，通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯來抑制癌細胞的增殖[6-7]。miR-451a是不同前體產(chǎn)生高度相似成熟miR-451的一種miRNA，miR-25-3p來源于前體miR-25 3′端莖環(huán)臂的miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組血清miR-451a、miR-25-3p的表達水平均高于良性組和對照組(P均<0.05)。miR-451a、miR-25-3p鑒別腫瘤組與對照組敏感性分別為86%、87%，特異性分別為93%、87%，鑒別腫瘤組與良性組的敏感性分別為97%、78%，特異性分別為87%、93%。先前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-25的高表達能夠抑制癌細胞的增殖[7]。PTC患者血清中miR-25的高表達可能是機體對PTC的自我調(diào)節(jié)。眾所周知，循環(huán)miRNA是腫瘤細胞死亡和裂解的產(chǎn)物，由腫瘤來源的微泡或外泌體釋放，可能來自癌癥相關(guān)的免疫反應(yīng)[8]。因此，PTC可以釋放更高水平的血漿miR-25-3p和miR-451a。

據(jù)報道，在PTC中，GAS8-AS1 c.713A>G/714T>C的核苷酸改變導(dǎo)致其RNA表達的顯著降低[9]。同時，與甲狀腺癌旁組織相比，沒有突變的PTC組織中也觀察到GAS8-AS1水平降低，因此GAS8-AS1的表達水平與PTC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，提示其可成為潛在的PTC生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組GAS8-AS1的表達水平低于良性組和對照組(P<0.05)。GAS8-AS1鑒別腫瘤組與對照組的敏感性和特異性均為83%。GAS8-AS1鑒別腫瘤組與良性組敏感性和特異性分別為97%和80%。異位表達的GAS8-AS1顯著抑制多種甲狀腺癌細胞系的細胞活力，而內(nèi)源性GAS8-AS1表達的降低可促進PTC細胞的增殖，提示GAS8-AS1是一個潛在的抑癌基因[10-11]。

本研究存在局限性，未對血清miR-25-3p、miR-451a和GAS8-AS1水平與臨床病理特征之間的潛在關(guān)系進行詳細分析，因為樣本量較小，難以進行分層和缺乏對這些miRNA的功能研究。因此，需要在更大群體中進一步研究，以評估血清miR-25-3p、miR-451a和GAS8-AS1水平作為PTC術(shù)前診斷以及預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物的價值。

綜上所述，血清miR-451a、miR-25-3p、GAS8-AS1的聯(lián)合檢測可作為診斷早期PTC的潛在標(biāo)志。