翠云草葉綠素代謝途徑及其關(guān)鍵酶

楊露露 李林

摘? ?要? ?通過(guò)比較藍(lán)色葉翠云草、紅色葉翠云草和綠色葉小翠云三者葉綠素合成途徑中11種產(chǎn)物的含量變化，分析翠云草葉綠素代謝途徑及其關(guān)鍵酶，為深入研究翠云草葉色變化內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，“原卟IX→鎂原卟啉IX”“原葉綠酸酯→葉綠酸酯a”這兩個(gè)環(huán)節(jié)是翠云草葉綠素代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，鎂離子螯合酶（CHLH）、光依賴的原葉綠酸酯氧化還原酶（LPOR）是相應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵酶?；趯?duì)翠云草葉綠素代謝途徑的分析，推測(cè)翠云草中葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b的效率大于其反向轉(zhuǎn)化的效率，導(dǎo)致葉綠素a/b值小于2，以適應(yīng)翠云草生長(zhǎng)的蔭蔽環(huán)境，滿足其葉綠素需求。

關(guān)鍵詞? ?翠云草;葉綠素;代謝途徑;關(guān)鍵酶

中圖分類號(hào)：S68? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.25.001

彩葉植物尤其是藍(lán)色葉植物在園林景觀應(yīng)用中較為少見。卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬（Selaginella）的翠云草（Selaginella uncinata）是一種藍(lán)色葉的蕨類植物，極具觀賞價(jià)值[1]。其葉片如羽毛般柔軟，在蔭蔽條件下呈現(xiàn)藍(lán)色，在全光照下變?yōu)榘导t色，葉色變化呈現(xiàn)的景觀效果很獨(dú)特，具有廣闊的園林應(yīng)用前景。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)翠云草的研究主要集中在基因組學(xué)、栽培繁殖、化工及藥理學(xué)方面。Tsuji等[2]、Smith[3]、Oldenkott等[4]對(duì)翠云草進(jìn)行了基因組學(xué)方面的研究。H Bant等研究了卷柏屬的藤卷柏（S. willdenovii）和翠云草，利用透射電子顯微鏡觀察其葉片橫切面的組織構(gòu)造，認(rèn)為翠云草的藍(lán)色葉與其葉片上層表皮的外側(cè)細(xì)胞壁內(nèi)兩層薄膜干涉濾器引發(fā)光的薄膜干涉有關(guān)[5]。鄭俊霞等[6]、邱宏聰?shù)萚7]、賴紅芳等[8]對(duì)翠云草的化學(xué)組成、提取工藝、藥理作用等進(jìn)行了研究。黃莉潔[9]、張旭樂等[10]、楊俊杰[11]總結(jié)了翠云草的引種人工栽培和繁殖技術(shù)。李林等[12]、LI L等[13]、張水木等[14]從翠云草葉色變化及其分子機(jī)理等方面探討了翠云草呈色變化機(jī)制。

本研究通過(guò)比較三種植物材料（藍(lán)色葉翠云草、紅色葉翠云草和綠色葉小翠云）葉綠素合成途徑中11種中間產(chǎn)物含量的變化，探討翠云草葉綠素代謝途徑的特點(diǎn)及關(guān)鍵酶，為深入研究翠云草葉色變化的內(nèi)在機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控葉色奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)基地位于廣西大學(xué)林學(xué)院苗圃（22°50′N，108°17′E）。盆栽（株齡均為6個(gè)月）翠云草和同屬的小翠云（S. kraussiana）購(gòu)自廣西花鳥市場(chǎng)，參照李林等[12]的方法對(duì)所用植物材料進(jìn)行預(yù)處理，得到全光照下栽培的紅色葉翠云草（圖1B），用于和放在三層遮蔭條件下栽培的藍(lán)色葉翠云草（圖1A）和綠色葉小翠云（圖1C）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

隨機(jī)采集植株各個(gè)方向正常生長(zhǎng)的成熟葉片，測(cè)定葉綠素生物合成各產(chǎn)物的含量。

1.2.1 葉綠素合成前體物質(zhì)的測(cè)定

利用全自動(dòng)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定葉綠素合成前體物質(zhì)的吸光值，其中δ-氨基酮戊酸（ALA）、膽色素原（PBG）、尿卟啉原Ⅲ（Urogen Ⅲ）、糞卟啉Ⅲ（Coprogen Ⅲ）、原卟啉IX（Proto IX）、鎂原卟啉IX（Mg-Proto IX）和原葉綠酸酯（Pchlide）含量的測(cè)定參照宗學(xué)鳳[15]、趙明輝等[16]、王平榮等[17]、楊海蕓[18]的方法，并適當(dāng)調(diào)整，單位均采用nmol·g-1。

1.2.2 葉綠素及其衍生物含量的測(cè)定

利用高效液相色譜法（WATERS E2695 HPLC系統(tǒng)）對(duì)葉綠素及其衍生物含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用保留時(shí)間和峰面積確定樣品中的物質(zhì)種類和含量。標(biāo)準(zhǔn)品葉綠素a（Chl a）和葉綠素b（Chl b）購(gòu)于Sigama公司。標(biāo)準(zhǔn)品葉綠酸酯a（Chlide a）和葉綠酸酯b（Chlide b）利用翠云草葉片中葉綠素酶（Chlase，參照Costa[19]的方法提?。┓謩e以標(biāo)準(zhǔn)品Chl a和Chl b為底物發(fā)生反應(yīng)得到，所得的Chlide a和Chlide b僅可進(jìn)行定性，無(wú)法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣中Chlide a和Chlide b的具體含量，因此在結(jié)果分析中以樣品中檢測(cè)出的峰面積相對(duì)比較三種植物材料葉片中Chlide a和Chlide b含量情況。

葉綠素及其衍生物的HPLC分析參照程紅艷等[20]的方法，略加改進(jìn)。取0.15 g植物葉片迅速加入5 mL甲醇溶液充分浸泡，并用超聲波機(jī)器震蕩15 min至無(wú)色，過(guò)濾待測(cè)。檢測(cè)條件為柱型C18（4.6 mm×250 mm，德國(guó)Nucleodur色譜柱），檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm，流動(dòng)相為A（甲醇、水的體積比為80∶20）和B（乙酸乙酯）。梯度洗脫為：0～20 min，A 100%～50%，B 0%～50%;20～40 min，A=50%，B=50%。流速設(shè)置為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)整理

利用Word 2010、Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖、制表，利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素合成前體物質(zhì)含量分析

從表1可以看出，除Coprogen Ⅲ外，其余各產(chǎn)物含量在三種葉色中都具有顯著性差異，但其大小的變化趨勢(shì)在三種葉色中不一致。

2.2 葉綠素及其衍生物分析

2.2.1 葉綠素及其衍生物HPLC圖譜

圖2為三種植物材料在430 nm處的葉綠素及其衍生物HPLC色譜圖。各主要物質(zhì)的出峰時(shí)間分別為：Chl a，29.846 min;Chl b，26.169 min;Chlide a，11.788 min。除Chlide b以外，另外3種物質(zhì)在三種植物材料中均可以檢測(cè)到。此外，三種葉色都在17.669 min處檢測(cè)到脫鎂葉綠素a（Pheide a）。

2.2.2 葉綠素及其衍生物含量分析

表2顯示，除葉綠素a/b外，三種植物材料中Chl a、Chl b、Chl a+b和Chlide a都存在顯著差異。Chl a、Chl b、Chl a+b的大小變化趨勢(shì)相同，都是藍(lán)色葉>綠色葉>紅色葉，且3種葉色中都是Chl a>Chl b。Chlide a的大小變化則是綠色葉>藍(lán)色葉>紅色葉。葉綠素a/b值均小于2，大小依次為紅色葉>綠色葉>藍(lán)色葉。

2.3 葉綠素合成產(chǎn)物相對(duì)含量比較

為了便于更直觀地分析和描述，將藍(lán)色葉中各物質(zhì)含量設(shè)定為100，與紅色葉和綠色葉進(jìn)行比較，且分別將葉綠素合成過(guò)程ALA→PBG→Urogen III→Coprogen Ⅲ→Proto IX→Mg-Proto IX→Pchlide→Chlide a→Chl a→Chl b命名為階段①～階段⑨，結(jié)果見圖3（參考楊露露[21]并做了一些改動(dòng)）。

1）在階段①，紅色葉中合成的前體物質(zhì)由原來(lái)藍(lán)色葉的135.25%下降到89.09%，緊接著在階段②又上升到148.99%，在階段③和階段④中，紅色葉>藍(lán)色葉的趨勢(shì)不變，但到了階段⑤，紅色葉中的合成產(chǎn)物急劇下降為藍(lán)色葉的32.39%，其后一直保持低于藍(lán)色葉的趨勢(shì)。根據(jù)以上藍(lán)色葉和紅色葉的比較分析，推測(cè)階段①ALA→PBG、階段②PBG→Urogen III和階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX是翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2）在階段③，綠色葉中合成的前體物質(zhì)由原來(lái)藍(lán)色葉的37.46%上升到100.76%，緊接著在階段④又下降到藍(lán)色葉的70.32%，在階段⑤和階段⑥中，藍(lán)色葉>綠色葉的趨勢(shì)不變，但到了階段⑦，綠色葉中的合成產(chǎn)物快速上升為藍(lán)色葉的128.34%，隨后階段⑧又急劇下降為71.06%，其后保持低于藍(lán)色葉的趨勢(shì)。根據(jù)以上藍(lán)色葉和綠色葉的比較分析，推測(cè)階段③Urogen III→Coprogen Ⅲ、階段④Coprogen Ⅲ→Proto IX、階段⑦Pchlide→Chlide a和階段⑧Chlide a→Chl a是翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.4 翠云草葉綠素合成產(chǎn)物相關(guān)性分析

將翠云草葉綠素合成途徑各中間產(chǎn)物：ALA、PBG、Urogen III、Coprogen III、Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide、chlide a的含量分別與葉綠素指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（見表3）顯示，前4個(gè)中間產(chǎn)物ALA、PBG、Urogen III、Coprogen III的含量與葉綠素各指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系，而后4個(gè)中間產(chǎn)物Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide、Chlide a的含量與葉綠素各指標(biāo)（除Chl a/b外）顯著相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

3.1 翠云草的耐陰性

植物在不同光照強(qiáng)度的生長(zhǎng)環(huán)境中，為滿足體內(nèi)葉綠素性能的需求，可以利用葉綠素循環(huán)，自我調(diào)整Chl a和Chl b的比值[22]。一般說(shuō)來(lái)，葉綠素含量高、Chl a/b比值小的植物具有較強(qiáng)的耐陰性。低的Chl a/b值能提高植物對(duì)遠(yuǎn)紅光的吸收，因而在弱光下，具有較低的Chl a/b值及較高的葉綠素含量的植物，也具有較高的光合活性。蕨類作為典型的陰生植物，Chl a/b值通常小于3∶1[23]。據(jù)丁曉浩等報(bào)道，其所測(cè)的10種觀賞蕨在3種不同光照處理下的Chl a/b值均小于3∶1，為（0.17～2.49）∶1[23]。

本研究中三種植物材料Chl a/b值均小于2，和丁曉浩等的研究結(jié)果[23]一致。其比值大小依次為紅色葉翠云草>綠色葉小翠云>藍(lán)色葉翠云草，說(shuō)明翠云草比同屬的小翠云耐陰，而紅色葉翠云草是受到強(qiáng)光脅迫形成的[12]，其耐陰性最差。

3.2 翠云草葉綠素合成關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵酶

根據(jù)前文（“2.3”節(jié)）藍(lán)色葉和紅色葉、綠色葉的比較分析，推測(cè)翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是階段①ALA→PBG、階段②PBG→Urogen III、階段③Urogen III→Coprogen Ⅲ、階段④Coprogen Ⅲ→Proto IX、階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX、階段⑦Pchlide→Chlide a和階段⑧Chlide a→Chl a這7個(gè)環(huán)節(jié)。

通過(guò)“2.4”節(jié)相關(guān)性分析可知，Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide 、Chlide a這4個(gè)產(chǎn)物與葉綠素指標(biāo)顯著相關(guān)。即圖3中的階段④→階段⑦環(huán)節(jié)與葉綠素合成的關(guān)系更為密切。

Li等根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)翠云草葉綠素代謝相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)鎂離子螯合酶（CHLH）、光依賴的原葉綠酸酯氧化還原酶（LPOR）、葉綠素酶（CLH）（即圖3中的階段⑤、階段⑦和階段⑨所對(duì)應(yīng)的3個(gè)酶）在藍(lán)色葉中比紅色葉中均有所上調(diào)[13]。

綜上，我們認(rèn)為階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX和階段⑦Pchlide→Chlide a這兩個(gè)環(huán)節(jié)是翠云草葉綠素代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，CHLH和LPOR是相應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵酶。

3.3 翠云草葉綠素代謝途徑

楊海蕓對(duì)花葉矢竹（Pseudosasa japonica f. akebonosuji）進(jìn)行葉色突變研究，發(fā)現(xiàn)引起其葉色變異的原因在于：Coprogen III→Proto IX這一中間過(guò)程（圖3中的階段④）生成的Proto IX與上一產(chǎn)物Coprogen III相比較，其相對(duì)含量水平急劇下降，導(dǎo)致花葉矢竹白色條紋葉Chl a、Chl b和總?cè)~綠素的含量均低于綠色葉，致使葉片顏色變淡或白化[18]。孫捷音等發(fā)現(xiàn)油菜（Brassica napus）的葉綠素合成途徑中，從PBG→Urogen III（圖3中的階段②），和野生型相比，其含量降低了一半，是Chl b的缺失造成了葉色突變[24]。董立花采用熒光光譜和紫外可見光譜分析了金心吊蘭（Chlorophytum capense var. Medio-pictum）葉綠素代謝流中間產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)其金心部分ALA、Proto IX和Pchlide的合成（圖3中的起始環(huán)節(jié)和階段④、階段⑥）受阻，且推測(cè)ALA合成受阻可能是其形成黃色葉條紋的主要原因[25]。上述各例都是由于葉綠素合成過(guò)程中Chl a、Chl b和總?cè)~綠素產(chǎn)生變化后導(dǎo)致葉色發(fā)生改變。Li等通過(guò)對(duì)藍(lán)色葉翠云草和紅色葉翠云草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找到了翠云草葉綠素代謝途徑中幾乎所有的酶，且基于兩個(gè)樣本中的葉綠素合成酶（Chlorophyllsynthase， CS）和葉綠素a加氧酶（CAO）的表達(dá)都沒有顯著差異的結(jié)果，推斷翠云草中兩種葉綠素的合成都沒有受阻[13]。

從L-谷氨酰-tRNA到Chl a，再到Chl b，整個(gè)葉綠素生物合成過(guò)程一共15步反應(yīng)，需要15種酶參與[17]。葉綠素循環(huán)過(guò)程從Chlide a開始，經(jīng)過(guò)CS酯化反應(yīng)形成Chl a。Chl b是由Chl a轉(zhuǎn)化形成的，在此過(guò)程中，Chlide a在CAO的催化下形成Chlide b，Chlide b在CS作用下形成Chl b。而Chl b在一定的條件下也可還原為Chl a。植物可以利用Chl a和b能夠相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)來(lái)調(diào)整葉綠素a/b的比值以適應(yīng)不同的生理?xiàng)l件和環(huán)境變化[26]。通常Chl a和Chl b吸收不同的波長(zhǎng)，前者吸收紅光而后者主要吸收藍(lán)紫光，在蔭蔽條件下，Chl b能夠利用環(huán)境中的藍(lán)紫漫反射光適應(yīng)光照條件。本試驗(yàn)應(yīng)用HPLC在三種葉色材料中檢測(cè)到Chl a、Chl b和Chlide a，但均未檢測(cè)到Chlide b，推測(cè)Chlide a在CAO催化下，產(chǎn)生的Chlide b迅速進(jìn)入下一步反應(yīng)生成Chl b，使得Chlide b在代謝流中不積累，即翠云草中Chl a轉(zhuǎn)化為Chl b的效率大于其反向轉(zhuǎn)化的效率，導(dǎo)致葉綠素a/b值小于2，以適應(yīng)翠云草生長(zhǎng)的蔭蔽環(huán)境，滿足其葉綠素需求。

圖4為我們參考Li等[13]并做了一些改動(dòng)，總結(jié)出的翠云草葉綠素代謝通路圖。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吉醒.蒼翠清新的翠云草[J].花木盆景（花卉園藝），2011（10）：10-11.

[2] Tsuji S， Ueda K， Nishiyama T， et al. The chloroplast genome from a lycophyte （microphyllophyte）， Selaginella uncinata， has a unique inversion， transpositions and many gene losses[J]. Journal of Plant Research， 2007， 120（2）： 281-290.

[3] Smith D R. Unparalleled GC content in the plastid DNA of Selaginella[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 71（6）： 627-639.

[4] Oldenkott B， Yamaguchi K， Tsuji-tsukinoki S， et al. Chloroplast RNA editing going extreme： more than 3400 events of C-to-U editing in the chloroplast transcriptome of the lycophyte Selaginella uncinata[J]. RNA， 2014， 20（10）： 1499-1506.

[5] H Bant C， LEE D W. Ultrastructural Basis and Developmental Control of Blue Iridescence in Selaginella Leaves[J]. American Journal of Botany， 1984， 71（2）： 216-219.

[6] 邱宏聰，陳小剛.壯藥材翠云草化學(xué)成分、藥理活性及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展[A].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì).中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第七次中藥分析學(xué)術(shù)交流會(huì)會(huì)議論文集[C].廣州，2014.

[7] 鄭俊霞，鄭揚(yáng)，顏秋萍，等.翠云草總黃酮的提取工藝研究[J].中藥材，2011（12）：133-135.

[8] 賴紅芳，溫曉娟.果膠酶法提取翠云草中總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（23）：34-36.

[9] 黃莉潔.觀賞蕨類卷柏——翠云草的引種栽培和繁殖技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2011（5）：86-88.

[10] 張旭樂，楊燕萍，黃建，等.蕨類植物翠云草栽培繁殖技術(shù)及園林應(yīng)用價(jià)值[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2009（6）：202-203.

[11] 楊俊杰.翠云草栽培管理技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)·溫室園藝，2015（4）：46-48.

[12] 李林，黃潔瑜，張水木，等.不同遮蔭處理對(duì)翠云草葉色變化的影響[J].分子植物育種，2015（5）：193-198.

[13] LI L， WANG Q， DENG R， et al. Transcriptome profiling of blue leaf coloration in Selaginella uncinata[J]. Canadian Journal of Plant Science， 2016， 97（4）： 580-593.

[14] 張水木，彭媛媛，李林.不同光質(zhì)處理對(duì)翠云草葉色變化的影響[J].北方園藝，2016（12）：75-79.

[15] 宗學(xué)鳳.水稻葉片全生育期黃化突變體ylg3葉綠素合成特性研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，35（11）：21-26.

[16] 趙明輝，隋陽(yáng)輝，陳溫福.超綠水稻葉綠素的生物合成[J].作物雜志，2010（6）：33-37.

[17] 王平榮，張帆濤，高家旭，等.高等植物葉綠素生物合成的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009（3）：207-214.

[18] 楊海蕓.花葉矢竹葉色變異機(jī)理研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2015.

[19] COSTA M L， CIVELLO P M， CHAVES A R， et al. Effect of ethephon and 6-benzylaminopurine on chlorophyll degrading enzymes and a peroxidase-linked chlorophyll bleaching during post-harvest senescence of broccoli （Brassica oleracea L.） at 20℃[J]. 2005， 35（2）： 191-199.

[20] 程紅艷，陳軍輝，張道來(lái)，等.超聲波輔助提取RP-HPLC法測(cè)定滸苔中的葉綠素a、b[J].海洋科學(xué)，2010，34（2）：23-27.

[21] 楊露露.觀賞蕨翠云草葉綠素代謝途徑研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2019.

[22] 李祖祥，呂梅，夏愛軍.遮陰對(duì)冷季型草坪草葉綠素含量和生物量的影響[J].草原與草坪，2017，37（5）：69-74.

[23] 丁曉浩，何云核.10種觀賞蕨類植物的耐陰性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：160-162.

[24] 孫捷音，張年輝，杜林方，等.油菜葉綠素b減少突變體Cr3529葉綠素生物合成的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（10）：1962-1966.

[25] 董立花.金心吊蘭的葉綠素生物合成以及光脅迫的耐受性[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[26] 陳熙.低葉綠素b水稻類囊體膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

（責(zé)任編輯：丁志祥）