熊 剛,鄒 華,胡承蓮,吳 丹,鄧貴柳
(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院急診科,恩施 445000)
由于人類生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,消化道疾病的發(fā)病率及病死率也不斷受到高度重視。結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性病變,其發(fā)生率僅次于胃癌、食管癌和肺癌等癌癥,并且流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)其致死率位居第3位[1]。對于惡性腫瘤的治療仍然依靠手術(shù),而術(shù)前、術(shù)后的輔助化療也是必不可少的環(huán)節(jié),但是臨床上常發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或腫瘤細胞轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是腫瘤細胞對多種化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥[2-3]。于是,腫瘤細胞的耐藥問題是目前急需解決的難題,早期研究已提出中藥也具有較好的抗腫瘤活性,而且還具有毒性作用小的特點[4]。綠原酸(ChA)是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物,主要分布于杜仲、金銀花等多種植物中,ChA在抑制腫瘤細胞增殖方面也具有較好的藥理活性[5-6],其中包括能夠抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[7],而且還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性[8]。前期報道跨膜轉(zhuǎn)運蛋白、細胞自噬均與腫瘤細胞的耐藥性相關(guān)[9]。因此,文章考察了轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白(P-gp)、肺抗藥性相關(guān)蛋白(LRP)及自噬蛋白Beclin1、高遷移率足蛋白B1(HMGB1)在結(jié)腸癌HCT116細胞耐5-氟尿密啶(5-FU)中的作用,還觀察了ChA對P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 蛋白表達的影響。
1.1 主要材料 結(jié)腸癌HCT116細胞株購自武漢巴菲爾公司(來自美國ATCC細胞庫);綠原酸(大連金港制藥有限公司,批號:HSP20170211);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司;胰蛋白酶購自Thermo Scientific公司;5-FU(深圳玩樂藥業(yè)有限公司,批號:SY20161107);CCK8試劑盒購自日本同仁公司(批號WST-78);RIPA裂解液購自上海吉諾公司;BCA試劑盒購自北京百奧公司;β-actin、P-gp、LRP、Beclin-1、HMGB1、p- 蛋 白 激 酶 B1(Akt1)、Akt1及mTOR抗體購自英國Abcam公司;HRP標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自上海谷歌公司;ECL 試劑盒(美國 Pierce,批號:32106)。
1.2 主要儀器 BBS-DDC超凈工作臺(山東博科科學(xué)儀器有限公司);LRH-150 BOD CO2細胞培養(yǎng)箱(上海印溪儀器表有限公司);Victor31420Multilable Counter酶標儀(DX540,美國);DYCZ-24DN 凝膠電泳儀(北京六一儀器廠);成像系統(tǒng)(BIO-RAD,美國)。
1.3 HCT116細胞培養(yǎng) HCT116細胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),CO2濃度為5%。5-FU耐藥的HCT116細胞系(HCT116-R)利用反復(fù)高濃度沖擊結(jié)合逐步遞增藥物劑量法[10]。具體步驟如下:將對數(shù)期HCT116細胞用5 mg/L 5-FU干預(yù)24 h,用不含Ca2+、P3-的磷酸鹽緩沖液D-Hanks清洗1遍,并加入不含藥物的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7~10 d,反復(fù)用5-FU沖擊處理,同時逐漸增大 5-FU 劑量(5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L),經(jīng)過8次沖擊后構(gòu)建成5-FU耐藥細胞系(HCT116-R)。待細胞恢復(fù)生長后將其維持培養(yǎng)于10 mg/L 5-FU完全培養(yǎng)液中,酶2~3 d傳代1次,停藥2周后進行后續(xù)實驗。
1.4 ChA影響5-FU對HCT116細胞增殖抑制實驗 把對數(shù)期的HCT116細胞制備成懸液,按每孔1×104個細胞接種于96孔板中,待細胞貼壁生長后,加入不同濃度(0、100、200、400 mg/L)的 ChA 及不同劑量(0、10、40、80、120、160、200 mg/L)的 5-FU 干預(yù)細胞48h后,除去舊培養(yǎng)液,每孔加入10μLCCK8溶液,再繼續(xù)培養(yǎng)細胞2 h,采用酶標儀在450 nm處測定細胞吸光度OD值,計算細胞活力,計算公式為:細胞活力(%)=細胞活力(%)=OD藥物組/OD對照組×100%。
1.5 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測ChA對HCT116-R細胞系中自噬、耐藥相關(guān)基因的影響 將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板進行實驗,待細胞貼壁生長24 h后,采用100、400 mg/L劑量ChA干預(yù)細胞48 h后,收集細胞加入Trizol提取細胞總RNA,并對核酸進行濃度及純度法測定。吸去1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA,程序設(shè)定為 30 ℃(10 min)→42 ℃(50 min)→85 ℃(10 min)→4℃(5 min)。根據(jù)試劑說明書,RT-PCR體系為20μL,cDNA2μL,引物4μL,2×FastFireqPCRPreMix 10 μL dd H2O 4 μL。擴增條件設(shè)置為:94 ℃(10 min),94℃(15 s),60℃(1 min),循環(huán) 40次。以 β-actin作為內(nèi)參,基因引物序列見表1。
1.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測ChA對HCT116-R細胞系中相關(guān)蛋白表達的影響 將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板進行實驗,待細胞貼壁生長24 h后,采用100、400 mg/L劑量ChA干預(yù)細胞48 h后,收集細胞冰上充分裂解30 min。收集細胞勻漿,4℃、離心半徑20cm,12000r/min離心13min,收集上清液,并采用BCA試劑測定總蛋白濃度;在蛋白電泳過程中,每孔蛋白上樣量為50 μg,濃縮膠70 V恒壓電離30 min,分離膠120 V恒壓電離90 min;然后將蛋白在275 mA恒流條件下轉(zhuǎn)至NC膜;5%脫脂牛奶封閉條帶1 h后,加入β-actin、LRP、Beclin-1、HMGB1、p-Akt1、Akt1 及 mTOR 抗體(稀釋比1∶1 000)4℃孵育過夜,洗膜后HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育1 h,洗膜3次,ECL顯色曝光,分析蛋白含量。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences list
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法,若方差不齊采用 Dunnett’s T3 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 ChA增強5-FU對HCT116細胞系增殖的抑制效應(yīng) 應(yīng)用不同濃度ChA及5-FU共同處理HCT116細胞系后,采用CCK8法考察ChA是否增強5-FU對HCT116細胞系增殖的抑制作用,見圖1。當5-FU濃度保持不變時,隨著ChA劑量的增高,HCT116細胞活力明顯降低;當ChA濃度保持不變時,較高濃度的5-FU能夠誘導(dǎo)HCT116細胞增殖活力的明顯降低。提示5-FU呈濃度依賴性抑制HCT116細胞增殖,并且ChA能夠促使5-FU對HCT116細胞的抑制作用。
2.2 HCT116、HCT116-R 細 胞 系 中 P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達比較 為了考察自噬及耐藥蛋白表達在HCT116細胞耐5-FU的作用,因此采用Western Blot分析了HCT116、HCT116-R細胞系中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達水平,見圖2。HCT116-R細胞系中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達量相對于HCT116細胞均顯著升高,差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示自噬及耐藥相關(guān)蛋白表達量的增高可能是HCT116細胞耐5-FU的機制。
圖1 ChA對呈濃度依賴性增強5-FU對HCT116細胞的抑制效應(yīng)Fig.1 ChA enhanced the inhibitory effect of 5-FU on HCT116 cells in a dose-dependent manner
圖2HCT116、HCT116-R細胞系中自噬及耐藥相關(guān)蛋白表達Fig.2 Expression of autophagy and drug resistance related proteins in HCT116 and HCT116-R cell lines
2.3 RT-PCR檢測 HCT116-R細胞 P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細胞后,提取總RNA,檢測P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達水平發(fā)現(xiàn),ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細胞中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表 2。
表2RT-PCR分析HCT116-R細胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1 mRNA表達Tab.2 Expression of P-gp,LRP,Beclin-1 and HMGB1 mRNA in HCT116-R cells by RT-PCR detection
2.4 Western Blot檢測HCT116-R細胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細胞后,提取總蛋白,檢測P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細胞中P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖 3。
圖3Western Blot分析HCT116-R細胞P-gp、LRP、Beclin-1及HMGB1蛋白表達Fig.3 Expression of P-gp,LRP,Beclin-1 and HMGB1 protein in HCT116-R cells by Western Blot detection
2.5 Western Blot檢測HCT116-R細胞中Akt1-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)分子通路蛋白 采用低、高劑量ChA干預(yù)HCT116-R細胞后,提取總蛋白,檢測自噬相關(guān)調(diào)節(jié)通路Akt1、mTOR蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),ChA呈劑量性的抑制了HCT116-R細胞中p-Akt1、Akt1、mTOR蛋白表達,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖 4。
圖4 Western Blot分析HCT116-R細胞p-Akt1、Akt1、mTOR蛋白表達Fig.4 Expression of p-Akt1,Akt1 and mTOR protein in HCT116-R cells by Western Blot detection
腫瘤患者在接受化療治療中,較多患者都會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,導(dǎo)致化療效果的降低,產(chǎn)生醫(yī)療資源浪費。于是,更多的國內(nèi)外研究人員集中于探索腫瘤耐藥機制及其治療方案。當前雖然在逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性方面已取得較大進步,但是因為大多數(shù)逆轉(zhuǎn)藥物存在毒副作用導(dǎo)致臨床上限制其應(yīng)用。中醫(yī)立足于辨證論治,以低毒、多靶點等優(yōu)勢常用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥,可以顯著改善腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。近期研究報道ChA可通過抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)進而下調(diào)跨膜轉(zhuǎn)運體P-gp、MRP1蛋白表達,從而有效逆轉(zhuǎn)人白血病細胞株的多藥耐藥[8]。于是,本研究探討了ChA對耐5-FU的HCT116細胞系的耐藥逆轉(zhuǎn)作用及相關(guān)作用機制。
腫瘤細胞耐藥主要集中于跨膜轉(zhuǎn)運體上,其中P-gp可介導(dǎo)多數(shù)化療藥物外排,由于腫瘤細胞中P-gp表達水平的上調(diào),導(dǎo)致P-gp介導(dǎo)化療藥物外排的活性增高,引起細胞內(nèi)有效藥物濃度降低。其中P-gp、肺抗藥性相關(guān)蛋白(LRP)屬于細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白,抗腫瘤藥物可由細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)外排增多,進而降低了藥物在細胞中積累,抑制了化療藥物的抗腫瘤活性。Levatic J等[11]報道Akt信號通路介導(dǎo)的耐藥性也許與激活P-gp蛋白表達有關(guān),在多種腫瘤細胞中,P-gp能夠利用腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)提供的能量介導(dǎo)藥物的外排升高而導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。LRP蛋白主要表達于體腔上皮、巨噬細胞、血腦屏障及分泌性器官[12],通過減少細胞內(nèi)DNA損傷藥物含量,進而減弱藥物對DNA的損傷作用,導(dǎo)致順鉑、烷化劑及5-FU的耐藥。已有研究報道LRP在肺腺癌細胞中表達明顯上調(diào)[13],進而誘導(dǎo)耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)ChA可以誘導(dǎo)5-FU對結(jié)腸癌HCT116細胞增殖活力的抑制作用,還能抑制HCT116-R細胞中P-gp、LRP mRNA及蛋白的表達。表明ChA能夠逆轉(zhuǎn)HCT116細胞對5-FU的耐藥,可能與降低細胞膜上P-gp、LRP蛋白表達,進而提升化療藥物在腫瘤細胞中的積累有關(guān)。
相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)細胞自噬與耐藥性密切相關(guān),證實通過抑制腫瘤細胞自噬,可提升患者對抗腫瘤藥物的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)自噬相關(guān)基因的表達可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞對多柔比星的耐藥性[14]。Bieri等[15]也證實抑制自噬基因Beclin-1表達可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對順鉑的耐藥性。文章研究發(fā)現(xiàn)ChA干預(yù)HCT116-R細胞,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、高遷移率族蛋白B-1(HMGB1)呈藥物劑量依賴性表達降低,降低了腫瘤細胞的自噬過程。Akt1/mTOR信號通路可介導(dǎo)細胞增殖、耐藥及自噬,并且該信號傳導(dǎo)激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16]。并且早期研究還發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過阻滯Akt1/mTOR信號傳導(dǎo)抑制腫瘤細胞增殖,通過降低Akt1、mTOR信號分子表達水平提升化療藥物的殺傷效果[17]。研究觀察到在HCT116-R細胞系中ChA能夠降低Akt1、mTOR基因表達,進而抑制Akt1/mTOR信號通路的活性,抑制結(jié)腸癌細胞的增殖,然而ChA是否直接與Akt1/mTOR信號通路分子發(fā)生相互作用來改變耐藥基因及自噬基因的表達,有待進一步深入研究。