超聲波輔助法提取銀杏葉多糖的工藝研究

豆佳媛，雷黛旖，逯 莉，彭修娟，劉 峰

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 西安 712046)

銀杏葉，為銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉[1]。銀杏葉多糖是一種淡黃色粉末，無(wú)甜味，不溶于水，主要由半乳糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖組成，通過α-糖苷鍵連接在一起[2]。銀杏葉多糖具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、增強(qiáng)免疫力[5]、延緩衰老[6]、抗疲勞[7]、降血脂[8]等多種藥理作用，醫(yī)藥開發(fā)前景廣闊[9]。目前，銀杏葉多糖的提取方法主要有水提醇沉法和纖維素酶結(jié)合水提醇沉法，但提取率不高、耗時(shí)長(zhǎng)[10-11]。超聲波輔助法是近年來(lái)興起的一種現(xiàn)代提取技術(shù)，其基本原理是：超聲波作用所發(fā)生的共振現(xiàn)象和空化作用使得被提取藥材的細(xì)胞壁破裂，有利于溶劑更好地進(jìn)入到藥材細(xì)胞中，增大有機(jī)物的溶解程度[12]，提高提取率。因此，作者采用超聲波輔助法提取銀杏葉多糖，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以期為銀杏葉多糖的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)[13-14]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

銀杏葉，采自秦嶺銀杏秋后自然落葉，預(yù)處理后干燥、粉碎過60目篩，備用。

95%乙醇，分析純，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；苯酚，分析純，西隴化工有限公司；濃硫酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)110833-201707)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Q700型超聲萃取儀，上海生析超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；U-2910型紫外可見分光光度計(jì)，日立有限公司；TCL18型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京永光明醫(yī)療儀器廠；DFY-C型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)，溫嶺林大機(jī)械有限公司；MS105DU型電子分析天平、JD-200型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖對(duì)照溶液的制備

精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.025 00 g置于25 mL容量瓶中，加純化水定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照溶液。

1.2.2 D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL置于10 mL具塞比色管中，加入純化水補(bǔ)到2 mL，搖勻；加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻；然后快速加入5 mL濃硫酸，置于冰水中5 min，用純化水定容至刻度，搖勻。放入沸水中加熱15 min，置于冰水中冷卻至室溫，再靜置30 min。以空白管為參照，測(cè)定625.5 nm處吸光度。

以D-無(wú)水葡萄糖濃度(c，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。擬合得線性回歸方程：A=1.2262c+0.0207，R2=0.9993。

圖1 D-無(wú)水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 銀杏葉多糖提取工藝流程

銀杏葉粉末→超聲波輔助法提取(以蒸餾水為提取劑)→離心過濾(收集上清液)→減壓濃縮至10～20 mL→醇沉→離心(取沉淀)→恒溫干燥→多糖粗品→定容顯色→測(cè)吸光度→計(jì)算提取率。

式中：c為多糖濃度，mg·mL-1；V為定容后的溶液體積，mL；m為干燥銀杏葉質(zhì)量，mg。

1.2.4 銀杏葉多糖提取工藝優(yōu)化

首先采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化銀杏葉多糖提取工藝。稱取5 g銀杏葉粉末5份，以蒸餾水為提取劑，分別考察料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g∶mL，下同)、超聲功率(100 W、200 W、300 W、400 W、500 W)、提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、超聲溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比(A)、超聲功率(B)、提取時(shí)間(C)等3個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響

由圖2可知，多糖提取率隨料液比的減小(即提取溶劑的增加)而逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25時(shí)，多糖提取率最高，之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)提取溶劑較少時(shí)，溶解出的多糖飽和，使銀杏葉多糖溶解不完全；當(dāng)提取溶劑較多時(shí)，超聲波被大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取率。因此，料液比為1∶25效果最佳。

2.1.2 超聲功率對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響(圖3)

圖3 超聲功率對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響

由圖3可知，多糖提取率隨超聲功率增大而升高，當(dāng)超聲功率超過300 W時(shí)，多糖提取率趨于平穩(wěn)。這可能是因?yàn)?，多糖的溶出量已?jīng)達(dá)到了平衡，超聲功率增大，反而導(dǎo)致多糖損失。因此，超聲功率為300 W效果最佳。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響(圖4)

圖4 提取時(shí)間對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響

由圖4可知，多糖提取率隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而升高；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)，多糖提取率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖提取率反而下降。這可能是因?yàn)?，多糖的溶出量已?jīng)達(dá)到了平衡，提取時(shí)間越長(zhǎng)，反而導(dǎo)致多糖損失。因此，提取時(shí)間為40 min效果最佳。

2.1.4 超聲溫度對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響(圖5)

由圖5可知，多糖提取率隨超聲溫度升高而緩慢升高，超過50 ℃后，多糖提取率緩慢降低。由此可見，超聲溫度對(duì)多糖提取率影響較小。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析(表1)

由表1直觀分析可知，3個(gè)因素的最優(yōu)水平組合為A1B2C3，即料液比為1∶20、超聲功率為300 W、提取時(shí)間為50 min。由極差分析可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響順序?yàn)椋篊>A>B,即提取時(shí)間>料液比>超聲功率，提取時(shí)間對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響最大。

圖5 超聲溫度對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響

表1 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析

2.2.2 方差分析(表2)

表2 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析

注：*表示顯著，**表示極顯著。

由表2可知，根據(jù)多指標(biāo)加權(quán)評(píng)分可以得出，影響銀杏葉多糖提取率的順序?yàn)椋篊>A>B,即提取時(shí)間>料液比>超聲功率，與極差分析結(jié)論一致。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)的可讀性，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。精密稱取5 g銀杏葉粉末3份，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，按料液比為1∶20(g∶mL)、超聲功率為300 W、提取時(shí)間為50 min的條件提取銀杏葉多糖，測(cè)得多糖提取率分別為4.59%、4.61%、4.59%，平均提取率為4.60%，RSD為0.2512%≤2.0%。確定該提取工藝穩(wěn)定性好、可行性高。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取銀杏葉多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定銀杏葉多糖的最佳提取工藝條件為：以蒸餾水為提取劑、料液比1∶20(g∶mL)、超聲功率300 W、提取時(shí)間50 min。在此條件下進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，銀杏葉多糖的平均提取率為4.60%。與傳統(tǒng)提取法相比，該工藝提取時(shí)間短、效率高、易操作、穩(wěn)定性好，為銀杏葉的開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的理論依據(jù)。