盧耀鳴 郭達 盧曉敏 鐘禮倫 鄧銘聰 吳柯柯 牛維 劉軍 林定坤

廣東省中醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510120

退行性膝關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)疼痛、活動受限、軟骨磨損為主要表現(xiàn)的疾病[1]。在發(fā)病過程中，以肥胖、血脂異常、血糖異常等為表現(xiàn)的代謝功能紊亂是影響骨關(guān)節(jié)炎進展的重要原因[2]。腸道菌群是寄生在動物體內(nèi)腸道環(huán)境的微生物的總稱，其種類繁多，功能復(fù)雜，是人體的“隱形器官”[3]，與代謝性疾病的發(fā)展過程密切相關(guān)。早期涉及腸道微生物組-關(guān)節(jié)軸中嚙齒動物模型和人體研究發(fā)現(xiàn)[4]，其與炎癥標志物水平升高如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)存在相關(guān)性，這表明微生物源性促炎性代謝產(chǎn)物是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)病的參與者。對腸道菌群及其與免疫對膝骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)影響的文獻回顧發(fā)現(xiàn)：存在腸道菌群種類或數(shù)量改變、比例失衡等紊亂時，可能通過影響腸上皮細胞的通透性或激活腸上皮細胞的炎癥因子，擴大炎癥反應(yīng)，造成了軟骨破壞，促進OA進程[5]。

本文對中國廣東地區(qū)健康人群及骨關(guān)節(jié)炎患者糞便菌群測試與分析，結(jié)合臨床資料，探討人群間腸道菌群差異，并對代謝指標進行分析，初步探討膝骨關(guān)節(jié)炎人群與健康人群腸道菌群差異性。

1 資料與方法

1.1 研究對象及樣本采集

選取2017年6～12月納入我院的健康人群29例，輕度關(guān)節(jié)炎患者17例及重度關(guān)節(jié)炎患者49例作為研究對象。關(guān)節(jié)炎組納入標準：①類風(fēng)濕、風(fēng)濕、自免、感染等指標檢測無異常；②無高血壓、冠心病等內(nèi)科合并癥，有關(guān)節(jié)疼痛、活動受限等病史，X線檢查關(guān)節(jié)炎分級(K-L分型)>1級，既往無膝關(guān)節(jié)外傷及手術(shù)史，無關(guān)節(jié)外畸形；③糞便寄生蟲檢測正常，既往無排便異?；蛳兰膊“l(fā)作史；④既往無長時間服用抗生素史，現(xiàn)采集標本前抗菌或抑菌藥物停用時間>1年；⑤自愿加入“中國南方人群糞便菌群樣本庫和患者臨床資料庫”并簽署知情同意書者；⑥根據(jù)2018年骨關(guān)節(jié)炎診療指南[6]排除存在其他部位關(guān)節(jié)炎的情況。健康人群對照組納入標準：①類風(fēng)濕、風(fēng)濕、自免、感染等指標檢測無異常；②無高血壓、冠心病等內(nèi)科合并癥，無關(guān)節(jié)疼痛、活動受限等病史，X線檢查關(guān)節(jié)炎分級(K-L分型)≤1級，既往無膝關(guān)節(jié)外傷及手術(shù)史，無關(guān)節(jié)外畸形；③糞便寄生蟲檢測正常，既往無排便異?；蛳兰膊“l(fā)作史；④既往無長時間服用抗生素史，現(xiàn)采集標本前抗菌或抑菌藥物停用時間>1年；⑤自愿加入“中國南方人群糞便菌群樣本庫和患者臨床資料庫”并簽署知情同意書者；⑥根據(jù)2018年骨關(guān)節(jié)炎診療指南[6]排除存在其他部位關(guān)節(jié)炎的情況。該研究的倫理委員會批注編號：Z2017-110。

1.2 研究方法

兩組人群標本采集前均進行詳細的病史采集，所有信息錄入ACCESS數(shù)據(jù)庫并進行校對處理?；颊呋蛑驹刚吲疟愫?，用無菌拭子取花生粒大小樣本凍存或放保護液中。血液樣本于入院檢查時一并提取。按照《糞便菌群DNA提取試劑盒》操作說明提取腸道菌群DNA。提取核酸后交宏基因組檢測公司檢測，檢測流程按SOP流程執(zhí)行。

1.3 膝骨關(guān)節(jié)炎腸道菌群微生物測序與分析

參照試劑盒說明書提取受試者的腸道菌群DNA，PCR擴增后上機測序。對測序數(shù)據(jù)進行分析并進行樣本區(qū)分，同時針對數(shù)據(jù)進行Q20、Q30等質(zhì)控分析、數(shù)據(jù)過濾。對最終獲得數(shù)據(jù)進行OUT歸并劃分，在此基礎(chǔ)上進行ALPHA多樣性分析，評估樣本多樣性水平和豐度分布，各樣本(組)在不同分類水平的具體組成，并檢驗組間是否具有統(tǒng)計學(xué)差異；BETA多樣性分析進一步衡量不同樣本(組)間的菌群結(jié)構(gòu)差異及關(guān)鍵物種篩選。使用Simpson多樣性指數(shù)分析群落多樣性，使LEfSe分析對群落關(guān)鍵物種進行篩選；差異物種GO分析及Pathway分析進行差異性菌群代謝功能預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 研究對象臨床信息

對納入研究的不同程度關(guān)節(jié)炎患者、正常健康人群者的臨床信息進行收集，用SPSS 23軟件對三組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析(One Way ANOVA)進行統(tǒng)計分析(表1)。三組研究對象在年齡、身高、體重均無明顯差異，在血脂和血糖水平上差異明顯；且在血脂、血糖、血膽固醇兩兩比較的統(tǒng)計中，健康人群組與關(guān)節(jié)炎組相比血脂與血糖具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而血膽固醇則差異不明顯；而兩種程度關(guān)節(jié)炎組相比血脂、血糖及血膽固醇差異均不明顯。

表 1 納入研究樣本的臨床信息匯總對比Table 1 Comparison and summary of all the clinical information of the study subjects

2.2 膝骨關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群宏基因組物種鑒定

Simpson多樣性指數(shù)是評價微生物群落Alpha多樣性的常用指數(shù)之一，Simpson指數(shù)值越高，表明群落多樣性越高。膝關(guān)節(jié)炎患者與健康人群對比發(fā)現(xiàn)，其腸道菌群多樣性低于健康人群(圖1 A)。將膝骨關(guān)節(jié)炎患者分為輕度、重度后，輕度患者與健康人群腸道菌群多樣性無顯著差異，重度患者腸道微生物多樣性顯著低于健康人群(圖1B)。

圖1 目標人群腸道菌群多樣性Shannon指數(shù)探究 A：健康人與膝關(guān)節(jié)炎患者腸道菌群多樣性對比；B：健康人、輕度膝關(guān)節(jié)炎患者、重度膝關(guān)節(jié)炎患者三組腸道菌群多樣性對比Fig.1 Shannon index of intestinal flora diversity in target population. A: Comparison of intestinal flora diversity between healthy people (Hg) and patients with knee arthritis (KO); B: Comparison of intestinal flora diversity among healthy people (Hg), patients with mild knee arthritis (KL1), and patients with severe knee arthritis (KL 2)

LEfSe分析是將線性判別分析與非參數(shù)的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗相結(jié)合，從而篩選關(guān)鍵的生物標志物。通過LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrphomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonadacease)等18種菌群在膝關(guān)節(jié)炎人群中顯著高豐度，毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)等6種菌群在膝關(guān)節(jié)炎人群中顯著低豐度。將膝關(guān)節(jié)炎人群分輕、重度兩個亞組后發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌屬、黃單胞菌屬兩類菌群可以顯著區(qū)分輕重型膝骨關(guān)節(jié)炎，是一種潛在的診斷標志物，其機制及普遍性正在進一步研究中。見圖2。

圖2 不同目標人群具有顯著差異的腸道菌群種屬 A：健康人與膝關(guān)節(jié)炎患者對比；B：健康人、輕度膝關(guān)節(jié)炎患者、重度膝關(guān)節(jié)炎患者對比?？v坐標為組間具有顯著差異的分類單元，橫坐標條形圖為對應(yīng)分類單元的LDA差異分析對數(shù)得分值，按得分值大小排序，以此描述它們在不同分組樣本中的差異大小。長度體現(xiàn)分類單元的差異性，條形圖顏色指示分類單元所對應(yīng)的豐度較高的樣本分組Fig.2 Species of intestinal flora with significant difference among different target populations. A: Comparison between healthy people (Hg) and patients with knee arthritis (KO); B: Healthy people (Hg), patients with mild knee arthritis (KL 1), and patients with severe knee arthritis (KL 2) were compared. The ordinate is the taxon with significant difference between groups, and the abscissa bar chart is the logarithm score value of LDA difference analysis of corresponding taxon, which is sorted according to the score value, so as to describe their differences in different grouping samples. The length reflects the diversity of taxon, and the color of bar chart indicates the sample group with higher abundance.

2.3 差異物種GO分析及Pathway分析

膝關(guān)節(jié)炎人群相對于健康人中差異性微生物(P<0.05)GO分析及Pathway分析顯示，與正常健康人相比，膝關(guān)節(jié)炎人群腸道差異性菌群在分子功能、生物過程、細胞組成存在顯著差異，包括細胞增殖過程的影響、機體系統(tǒng)的影響、人體疾病產(chǎn)生的影響等，具體對機體影響較大的功能富集結(jié)果見圖3。結(jié)果中寡養(yǎng)單胞菌屬、黃單胞菌屬等菌群顯著升高，對代謝類疾病、感染性疾病、心血管類疾病、免疫性疾病的發(fā)病具有增加的趨勢；對細胞轉(zhuǎn)移、細胞增殖等具有顯著影響；對機體神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等具有巨大的影響，這些影響與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病不無關(guān)系。

圖3 不同人群腸道差異性菌群代謝功能預(yù)測，紅色為健康人，藍綠色為膝關(guān)節(jié)炎人群?！靶√崆佟钡摹芭质荨狈从沉藰颖緮?shù)據(jù)分布的密度高低(寬度越寬，表明該豐度下對應(yīng)的樣本越多)；箱線圖邊框代表上下四分位數(shù)間距(interquartile range，IQR)，橫線代表中位值，上下觸須分別代表上下四分位以外的1.5倍IQR范圍，符號“?”表示超過范圍的極端值Fig.3 The prediction of metabolic function of intestinal flora in different populations. Red is healthy people, and blue-green is knee arthritis population. The “fat and thin” of “Violin” reflects the density of the sample data distribution (the wider the width, the more samples corresponding to the abundance). The border of the box diagram represents the interquartile range (IQR). The horizontal line represents the median value. The upper and lower tentacles represent the 1.5 times IQR range beyond the upper and lower quartiles. The symbol “·” indicates the extreme value beyond the range.

通過KEGG注釋(包括 KOs、Enzymes、Modules及Pathways 4個層面對蛋白分子的生物學(xué)功能進行標注)，對差異性菌群進行了代謝功能分析(圖4)，結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)炎人群腸道菌群環(huán)境對機體的氨基酸代謝、糖代謝、脂質(zhì)體代謝、核苷酸代謝、糖類合成與代謝等關(guān)系密切；并且黃單胞菌屬等菌群與腸道內(nèi)生物降解與代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝輔助因子和維生素代謝等也關(guān)系密切。

3 討論

腸道微生物組-關(guān)節(jié)軸的研究是一個新興的研究領(lǐng)域。Collins等[7]對高脂/高糖飲食喂養(yǎng)的大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖動物軟骨損傷增加、血清LPS水平和Mankin組織學(xué)評分之間存在直接相關(guān)；16S測序發(fā)現(xiàn)，腸道微生物組組成中乳酸桿菌屬和甲烷桿菌屬菌群增加，豐度與組織學(xué)評分有預(yù)測關(guān)系。Ulici等[8]對無菌小鼠研究發(fā)現(xiàn)，無菌狀態(tài)下，創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度有所降低；提示腸道微生物組骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機理中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，健康人群組腸道菌群與KOA組，在菌群數(shù)量占比以及菌種的比較上均有明顯差異。在菌群多樣性上，健康人組與輕度KOA組差異不大，而輕、重度關(guān)節(jié)炎組相比差異性較大。從菌群物種統(tǒng)計及LDA差異分析發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌屬、黃單胞菌屬等18種菌群在KOA人群中呈顯著高豐度，毛螺旋菌屬、瘤胃球菌屬等6種菌群在KOA人群中呈顯著低豐度。按KOA程度分為輕、重兩個亞組后發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌屬、黃單胞菌屬兩類菌群可以顯著區(qū)分輕重度KOA。

圖4 膝關(guān)節(jié)炎人群腸道差異性菌群代謝功能預(yù)測，圖中橫坐標為KEGG第二等級功能類群，縱坐標為各功能類群在各樣本(組)內(nèi)的相對豐度Fig.4 The abscissa is the second level functional group of KEGG. The ordinate is the relative abundance of each functional group in each sample (group)

通過差異物種GO分析及Pathway分析提示關(guān)節(jié)炎人群腸道菌群環(huán)境對機體的氨基酸、糖、脂質(zhì)、核苷酸、糖類合成與代謝等關(guān)系密切；黃單胞菌屬等菌群與腸道內(nèi)生物降解與代謝、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝輔助因子和維生素代謝等也關(guān)系密切。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌作為革蘭氏陰性菌的一種，其菌株內(nèi)含有Ⅱ型分泌系統(tǒng)是革蘭陰性菌的常規(guī)代謝途徑，其向胞外分泌多種蛋白，包括蛋白酶、內(nèi)毒素等相關(guān)物質(zhì)。辛?xí)阅莸萚9]通過PCR擴增、測序的方法發(fā)現(xiàn)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分泌系統(tǒng)基因簇中的GspF和GspE序列在種內(nèi)高度保守，與其他菌株有顯著差異，提示其Ⅱ型分泌系統(tǒng)機制可能顯著區(qū)別于其他革蘭陰性菌，這為深入研究寡養(yǎng)單胞菌屬與關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的關(guān)系提供一定研究方向。本研究基線比較中可觀察帶關(guān)節(jié)炎患者的血糖、血脂顯著高于健康者，結(jié)合差異物種GO分析及Pathway分析，提示相關(guān)菌群可能通過代謝途徑影響骨關(guān)節(jié)炎的進程的理論可能性。

黃單胞菌屬菌群中，甘藍黑腐病黃單胞菌具有分泌細胞外雜多糖——黃原膠(Xanthan gum)的能力[10]。其理化性質(zhì)與透明質(zhì)酸鈉相近，而透明質(zhì)酸是廣泛認可的防止骨關(guān)節(jié)炎進展的關(guān)節(jié)腔注射首選藥物。Han等[11]通過兔骨關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃原膠有保護關(guān)節(jié)軟骨的作用，但黃原膠與腸道菌群及骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系尚未明確，仍需進一步實驗探討。

在低豐度菌種中，毛螺旋菌屬有可能與免疫性疾病相關(guān)。陳小玉等[12]通過對初診及非初診再生障礙性貧血患者群體進行干細胞移植前后腸道菌群比較發(fā)現(xiàn)，初診組及非初診組毛螺菌科比對照組降低，移植前組毛螺菌科也比對照組降低。骨關(guān)節(jié)炎作為代謝性及免疫性疾病的一種，其發(fā)生發(fā)展無不與免疫系統(tǒng)相關(guān)，在此實驗理論基礎(chǔ)上進行深入研究挖掘，有助于探討毛螺旋菌屬與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的具體關(guān)聯(lián)。

當前研究發(fā)現(xiàn)健康人群與關(guān)節(jié)炎人群糞便菌群結(jié)構(gòu)有明顯不同，樣本量局限于中國廣東地區(qū)，由于飲食、地域等因素單一樣本的代表性并不一定能為潛在機理提供支持證據(jù)。在中國，不同地方常住人口也有不同民族之分，其飲食結(jié)構(gòu)也能導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異[13]，對不同人群的飲食及人群特點進行分析，有助于揭示腸道菌群與OA發(fā)病相關(guān)機制；開展對顯著豐度差異的菌屬研究，探索腸道菌群介導(dǎo)OA的發(fā)病機制有可能為骨關(guān)節(jié)炎的防治研究提供新方向。