數(shù)控剪應(yīng)力微流裝置評(píng)價(jià)新加達(dá)原散對(duì)MRSA生物膜的影響

石巖 齊文升

摘要 目的：通過(guò)XTT法和微流體系統(tǒng)觀察評(píng)價(jià)新加達(dá)原散對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量生物膜形成的影響作用。方法：1）XTT法觀測(cè)空白組、萬(wàn)古霉素組及新加達(dá)原散組（水提取、醇提?。?duì)MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株生物膜成熟期膜內(nèi)活菌的影響。2）Bioflux200系統(tǒng)中接種MRSA菌至觀察區(qū)，細(xì)菌生物膜形成后分別在各進(jìn)孔加入一定濃度的新加達(dá)原散水提物、醇提物及萬(wàn)古霉素，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組和空白組。然后在0.5 dyne剪切力作用下連續(xù)培養(yǎng)30 h，觀察各組生物膜的形成情況。結(jié)果：1）XTT法觀測(cè)結(jié)果顯示，新加達(dá)原散可明顯減少形成期及成熟期MRSA生物膜膜內(nèi)活菌數(shù)量。2）2種濃度新加達(dá)原散水提物、醇提物組生物膜形成面積明顯減少，空白組、溶劑對(duì)照組生物膜面積增大，萬(wàn)古霉素組生物膜形成面積較前減少，但無(wú)新加達(dá)原散2組明顯。結(jié)論：新加達(dá)原散減少了MRSA生物膜膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。在流動(dòng)狀態(tài)下，一定濃度新加達(dá)原散在剪切力的作用下可抑制MRSA生物膜的形成;Bioflux200可以用于抑制細(xì)菌耐藥中藥的療效評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 新加達(dá)原散;耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;生物膜;XTT法;微流裝置;剪應(yīng)力;濃度;評(píng)價(jià)

Abstract Objective：To observe and evaluate the effect of Xinjia Dayuan Powder on the formation of the number of bacteria in the biofilm of methicillin-resistant Staphylococcus aureus standard strains by using The XTT method and microfluidic system Methods：1）The XTT method was used to observe the effects of the blank group，vancomycin group and Xinjia Dayuan Powder group（water extraction，alcohol extraction）on the living bacteria in the MRSA standard strain biofilm at the mature stage.2）We inoculated MRSA bacteria in the Bioflux200 system to the observation area.After the bacterial biofilm was formed，we added a certain concentration of Xinjia Dayuan Powder water extract，alcohol extract，solvent control group，blank group and vancomycin to each inlet hole，and then under the action of 0.5 dyne shearing force，they were continuously cultured for 30 h to observe the formation of biofilm in each group.Results：1）XTT method showed that Xinjia Dayuan Powder can significantly reduce the number of viable bacteria in the MRSA biofilm during the formation and maturation phase.2）The area of biofilm formation in the water extract and alcohol extract group of the 2 concentrations of Xinjia Dayuan Powder decreased significantly，the area of biofilm formation in the blank group and solvent control group increased，and the area of biofilm formation in the vancomycin group decreased compared with the previous one，but not significantly different than the 2 groups of Xinjiada Yuan Powder.Conclusion：Xinjia Dayuan Powder can reduce the number of bacteria in MRSA biofilm.In the flowing state，a certain concentration of Xinjia dayuan Powder can inhibit the formation of MRSA biofilm under the action of shearing force; Bioflux200 can be used to evaluate the curative effect of antibacterial Chinese medicine.

Keywords XinJia Dayuan Power; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Biofilm; XTT method; Microfluidic device; Shear stress; Concentration; Evaluation

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.008

抗生素耐藥性已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。[1]耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus，MASR）更是臨床上常見(jiàn)的耐藥細(xì)菌。CHINET[2]2017年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株顯示出對(duì)整組β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)環(huán)境而分泌出多糖基質(zhì)、脂蛋白等多種物質(zhì)復(fù)合的多糖復(fù)合物，是能夠粘連、纏繞并聚集不同細(xì)菌在多糖復(fù)合物內(nèi)而形成的膜樣物[3]。由于MASR膜形成能力極強(qiáng)[4]，引起感染的特點(diǎn)往往為不同期交替發(fā)作、易復(fù)發(fā)以及難治愈[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥與其形成生物膜有很大相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)研宄通過(guò)對(duì)照觀察空白組、新加達(dá)原散組（水提取和酯提?。┖腿f(wàn)古霉素組對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株細(xì)菌生物膜成熟期內(nèi)活菌數(shù)量的影響，及數(shù)控剪應(yīng)力微流裝置對(duì)4組成熟期生物膜形成動(dòng)態(tài)纏繞并聚集不同細(xì)菌在多糖復(fù)合物內(nèi)而形成的膜樣物影響的觀察，探究新加達(dá)原散對(duì)體外生物膜形成的影響以及膜內(nèi)細(xì)菌的抑制作用。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MRSA（ATCC，美國(guó)，型號(hào)：43300），購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心，接種至LB平板，4°冰箱保存。

1.1.2 藥物 新加達(dá)原散顆粒劑：柴胡、青黛等（新綠色藥業(yè)股份有限公司提供，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥劑科對(duì)每枇煎劑樣本進(jìn)行紋圖分析比照）;注射用鹽酸萬(wàn)古霉素Vancomycin（ELILILLY ITALIA S.P.A，意大利，批號(hào)：C659149）;乙醇（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：10009527）;胰蛋白胨、酵母提取物（Oxoid，英國(guó)，批號(hào)：1863590，1390139-02）;氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20180509）;XTT（SIGMA，美國(guó)，型號(hào)：X4626）;吩嗪硫酸甲酯（PMS）（SIGMA，美國(guó)，型號(hào)：P9625）。

1.1.3 試劑與儀器

1.1.3.1 試劑 LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 mg/L，酵母提取物5 mg/L，氯化鈉10 mg/L，葡萄糖2.5 mg/L，pH 7.4～7.6，超純水配制，高壓蒸汽滅菌，4°保存）;含糖LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 mg/L，酵母提取物5 mg/L，氯化鈉10 mg/L，pH 7.4～7.6，超純水配制，高壓蒸汽滅菌，4°保存）;磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1010）超純水定容2L，髙壓蒸汽滅菌，室溫保存;0.9%氯化鈉溶液（氯化鈉9 g/L。用超純水配制）;XTT溶液（將稱(chēng)量好的XTT粉末加含糖LB培養(yǎng)基配成1 mg/mL的溶液，水浴70 ℃加熱至充分溶解實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用，注意避光）;PMS溶液（將稱(chēng)量好的PMS粉末加超純水配成3.06 mg/mL的溶液，0.22 pm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置4 ℃冰箱避光保存）;新加達(dá)原散醇提物（精確稱(chēng)量新加達(dá)原散顆粒劑，反復(fù)用乙酸乙酯溶解中藥顆粒劑，1 000 r/min離心5 min，取上清液至一燒杯;直到所收集的乙酸乙酯上清液肉眼觀為無(wú)色透明;將收集的上清液經(jīng)旋蒸儀蒸干至粉末狀，用無(wú)水乙醇溶出，制成按顆粒原劑量計(jì)算為5 g/mL的濃縮液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?新加達(dá)原散水提物（將上述乙酸乙酯提物余下的藥液用水充分溶解，水溶液離心除雜質(zhì);上清液水浴蒸干后用定量的LB培養(yǎng)基溶解制成250 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌分裝入EP管內(nèi)置置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

1.1.3.2 儀器 24孔板（康寧，美國(guó)，型號(hào)：3524），接菌環(huán)（Biologix，美國(guó)，型號(hào)：65-0001），生物安全柜（西班牙泰事達(dá)公司，西班牙，型號(hào)：BIO II Advance），恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BINDER，德國(guó)，型號(hào)：KMF240），全自動(dòng)八道洗板機(jī)（美國(guó)伯騰儀器有限公司，美國(guó)，型號(hào)：ELX50），分光光度計(jì)（三洋電機(jī)株式會(huì)社，日本，型號(hào)：MLS-3750），恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備，型號(hào)：THZ-D），Bioflux200型數(shù)控剪切流活細(xì)胞自動(dòng)分析平臺(tái)系統(tǒng)（Fluxion Biosciences，美國(guó)，型號(hào)：Bioflux200）酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：iMark），共聚焦激光掃描顯微鏡（Oympus公司，日本，型號(hào)：FV1000），Bio Flux WPM 48 Well Plates（Fluxion Biosciences，美國(guó)，型號(hào)：910-0003）。

1.2 方法

1.2.1 XTT法檢測(cè)藥物作用后MASR生物膜膜內(nèi)形成期和成熟期活菌量 1）菌液配制：從MASR的LB培養(yǎng)皿上挑取單菌落置于少許LB液體培養(yǎng)基中，恒溫280 r/min震蕩16 h，后將菌液稀釋至OD600=0.1[7]。2）XTT法檢測(cè)：將新加達(dá)原散水提物、醇提物分別用含糖LB培養(yǎng)基倍，萬(wàn)古霉素為溶劑1 mg/mL;乙醇稀釋濃度同醇提部分[8]。最后微孔板法檢測(cè)MRSA生物膜成熟期的活菌量，取2個(gè)96孔板，空白對(duì)照組加入如下同體積的培養(yǎng)液菌液和藥液（倍比稀釋法加藥[9]），37 ℃恒溫恒濕48 h后洗板機(jī)洗板后加入XTT-PMS，1.5 h后酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。

1.2.2 數(shù)控剪應(yīng)力微流裝置評(píng)價(jià)藥物作用后耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜影響 1）菌液配制：方法同上。2）藥液配制：取上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行藥液濃度配置，將新加達(dá)原散水提物用含糖LB培養(yǎng)基配125 mg/mL，醇提物配成250 mg/mL;萬(wàn)古霉素配成終末濃度0.08 mg/mL?？瞻讓?duì)照（培養(yǎng)基）、乙醇稀釋濃度同醇提部分溶劑對(duì)照（無(wú)水乙醇）。

1.2.3 Bioflux系統(tǒng)下觀察藥后MRSA菌生物膜的影響 1）將Bioflux系統(tǒng)[10]切開(kāi)孔的薄膜后，先用培養(yǎng)基將BioFlux Plate潤(rùn)濕。于出口加入200 μL培養(yǎng)基。出口至入口方向加力5 dyn/cm2，5 min;靜置1 h;吸去入口及出口廢液。2）加入菌液。入口加入100 μL培養(yǎng)基，出口加入100 μL菌液;出口至入口方向加力2 dyn/cm2，5 s，顯微鏡下見(jiàn)觀察窗內(nèi)布滿細(xì)菌;靜置2 h;棄去入口及出口廢液。3）生物膜培養(yǎng)。入口加入1 mL培養(yǎng)基，出口加入100 μL培養(yǎng)基;入口至出口方向加力0.5 dyn/cm2。于37 ℃培養(yǎng)30 h，每15 h更換培養(yǎng)基。4）分組給藥：吸去入口廢液后，分為空白組（于入口處加入1 mL培養(yǎng)基）、無(wú)水乙醇對(duì)照組、水溶實(shí)驗(yàn)組、醇溶實(shí)驗(yàn)組、萬(wàn)古霉素組。在0.5 dyn/cm2下37 ℃恒溫加熱板培養(yǎng)。取像1 h/1次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Bioflux Montage圖像處理軟件的Fluorescence Adhesion以及Percent area模塊進(jìn)行圖像自動(dòng)分析并統(tǒng)計(jì)。利用Graph Pad Prism 5.0繪圖。

2 結(jié)果

2.1 微孔板法結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，在生物膜成熟后，一定濃度的萬(wàn)古霉素對(duì)MASR生物膜形成期內(nèi)活菌量有作用，而新加達(dá)原散水提物在125～62.5 mg/mL濃度范圍都能顯著減少膜內(nèi)活菌量，新加達(dá)原散醇提物在250～31.25 mg/mL濃度范圍都能顯著減少膜內(nèi)活菌量。依據(jù)以上結(jié)果，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將2組新加達(dá)原散組濃度分別設(shè)定為250 mg/mL（醇提物）、125 mg/mL（水提物），萬(wàn)古霉素組濃度設(shè)0.08 mg/mL。見(jiàn)表1，圖1。針對(duì)乙醇?xì)缂?xì)菌作用考慮該溶劑對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌是否有殺滅作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示乙醇溶劑對(duì)MASR生物膜內(nèi)活菌影響不明顯。見(jiàn)圖2。

2.2 新加達(dá)原散對(duì)MRSA菌生物膜形成的影響 ? 利用Bioflux Montage圖像處理軟件進(jìn)行圖像自動(dòng)分析，空白組、無(wú)水乙醇對(duì)照組均形成了較致密的菌斑生物膜并隨時(shí)間變化生物膜面積逐漸增加。250 mg/mL新加達(dá)原散（醇提物組）、125 mg/mL新加達(dá)原散（水提物組）、萬(wàn)古霉素組均有菌斑生物膜形成，給藥后隨著時(shí)間變化生物膜面積逐漸減少，其中125 mg/mL新加達(dá)原散（水提物組）細(xì)菌生物膜面積減少最為明顯，萬(wàn)古霉素組生物膜面積變化較小。見(jiàn)圖3，表2。

3 討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜被視為細(xì)菌耐藥性的一種方式[11]。抗生素能夠有效殺死生長(zhǎng)和分裂的細(xì)菌[12]?？股乜梢酝ㄟ^(guò)殺死自由漂浮的細(xì)菌，但通常不能根除嵌入的細(xì)菌生物膜中的細(xì)菌?？股仉A段治療后停止使用，細(xì)菌仍然可以恢復(fù)成生長(zhǎng)狀態(tài)形成生物膜進(jìn)而導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)[13-14]。萬(wàn)古霉素被認(rèn)為是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的推薦用藥，卻具有明顯的腎毒性，不宜長(zhǎng)期使用了[15]。生物膜中的細(xì)菌處于休眠狀態(tài)這類(lèi)似于潛在的致病因素，與中醫(yī)伏邪有異曲同工之妙。吾師認(rèn)為伏邪治療應(yīng)從兩方面入手：1）清解：伏邪發(fā)則為溫病，故性屬熱邪，無(wú)論熱邪潛伏，還是外邪入里化熱，皆當(dāng)“熱者寒之”。2）透散：邪氣內(nèi)伏，宜調(diào)節(jié)氣機(jī)升降，透散外達(dá)，給邪以出路，若單用苦寒直折，易冰伏邪氣，加重病情。故創(chuàng)建本方，即根據(jù)中醫(yī)“伏邪”理論，由“達(dá)原飲”“升降散”“小柴胡湯”的構(gòu)成，主要研究新加達(dá)原散不同于常規(guī)

圖3 給藥前后4組MASR生物膜形成變化

的治療細(xì)菌感染的清熱解毒方法。本方講求“清熱涼血、透膜散結(jié)、調(diào)節(jié)氣機(jī)升降出入”，以清透為治療大法，其組方特點(diǎn)和配伍方法，具備中醫(yī)理論和臨床治療特色，比西醫(yī)治療有很大的優(yōu)勢(shì)和臨床價(jià)值。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，只有一定高濃度（臨床往往達(dá)不到）萬(wàn)古霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的成熟期才有影響。新加達(dá)原散顆無(wú)論是水提取物還是乙醇提取物對(duì)成熟的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成有明顯的作用。體外實(shí)驗(yàn)有一定局限性：1）細(xì)菌體外實(shí)驗(yàn)生物膜可能不準(zhǔn)確代表體內(nèi)生物膜[16]。2）治療方案中能夠完全清除既定范圍內(nèi)的所有生物膜慢性細(xì)菌感染仍有待鑒定[17]。3）新加達(dá)原散在體外和體內(nèi)是否一致仍有待討論。4）本研究也只針對(duì)生物膜耐藥，不涉及其他耐藥方式。建議對(duì)生物膜成膜能力進(jìn)行鑒定以及對(duì)新加達(dá)原散抑制MASR生物膜耐藥機(jī)制進(jìn)一步研究，對(duì)臨床大數(shù)據(jù)的MASR臨床菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與試驗(yàn)研究來(lái)完善新加達(dá)原飲對(duì)MASR生物膜耐藥的系統(tǒng)生物學(xué)研究。

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