RAP1A和EPAC1在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義*

沈利聰，板得瑩，張瑜

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 婦科，湖南 長(zhǎng)沙410008）

子宮內(nèi)膜異位癥是最常見(jiàn)的婦科慢性疾病之一，育齡期婦女發(fā)病率為10%～15%[1]。子宮內(nèi)膜異位癥主要引起疼痛、不孕和盆腔包塊，70%～93%青少年期女性痛經(jīng)因其引起，而15%～50%的女性不孕癥是由其導(dǎo)致[2]。據(jù)中國(guó)婦科疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查顯示，子宮內(nèi)膜異位癥的疾病負(fù)擔(dān)為婦科疾病的第3 位[3]。子宮內(nèi)膜異位癥是良性疾病，卻具有惡性腫瘤的一些特性，如侵襲性、復(fù)發(fā)性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約有1%患者可能惡變，被稱(chēng)為“良性腫瘤”[4]。但目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

多種假說(shuō)如經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、干細(xì)胞學(xué)說(shuō)、細(xì)胞增殖與凋亡失衡等從不同角度闡釋可能引起子宮內(nèi)膜異位癥的病因及發(fā)病機(jī)制，然而，沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能完全解釋其內(nèi)在機(jī)制[1，5]，表明子宮內(nèi)膜異位癥是一種多因素、多種機(jī)制參與導(dǎo)致的慢性疾病。RAS 相關(guān)蛋白1（Ras-associated protein 1, RAP1）是RAS 小G 蛋白家族中的一員，通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1由2 種異構(gòu)體組成，即RAP1A 和RAP1B。研究發(fā)現(xiàn)，RAP1A 在肝癌、胰腺癌、食管癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡失衡等多種生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-11]。環(huán)磷酸腺苷交換蛋白1（the exchange protein directly activated by cAMP1, EPAC1）是一種非蛋白激酶A 依賴(lài)的信號(hào)分子，是環(huán)磷酸腺苷cAMP 的下游效應(yīng)分子。EPAC1 參與GDP/GTP 交換，將RAP1 結(jié)合的鳥(niǎo)苷二磷酸置換為鳥(niǎo)苷三磷酸，引起RAP1 激活。EPAC1/RAP1 通路參與細(xì)胞增殖、分化、黏附等多種生物學(xué)功能[12-14]。然而，RAP1A 和EPAC1 在子宮內(nèi)膜異位癥的作用尚無(wú)研究報(bào)道。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法及Western blotting 法檢測(cè)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥及正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)，并探討兩者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年6月—2020年1月中南大學(xué)湘雅醫(yī)院婦科因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔鏡手術(shù)患者18 例，年齡22 ～45 歲，平均（32.72±4.95）歲；取異位及在位內(nèi)膜組織各18 份。取15 例卵巢單純性囊腫或畸胎瘤（鏡下未見(jiàn)卵巢及盆腔內(nèi)膜異位病灶）患者的子宮正常內(nèi)膜組織作為對(duì)照，年齡20 ～43 歲，平均（30.28±4.41）歲。所有組織經(jīng)甲醛固定、脫水后石蠟包埋。所有研究對(duì)象均為月經(jīng)周期規(guī)律的育齡期婦女，根據(jù)末次月經(jīng)及病理檢查證實(shí)所有內(nèi)膜組織均為增生期，術(shù)前3 個(gè)月未接受任何激素治療，術(shù)后病理檢查證實(shí)為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥或子宮正常內(nèi)膜。根據(jù)r-AFS 分期標(biāo)準(zhǔn)，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者均為Ⅲ、Ⅳ期。各組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)執(zhí)行（#201910255）。

1.2 試劑及儀器

兔抗人RAP1A 單克隆抗體（MA1-103）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，兔抗人EPAC1 單克隆抗體（ab109415）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，掃描儀購(gòu)自愛(ài)普生（中國(guó)）有限公司，顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司，轉(zhuǎn)膜儀、圖像分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

石蠟包埋的組織標(biāo)本進(jìn)行4 μm 連續(xù)切片，將切片置于65℃恒溫箱烤片30 min，接著予松節(jié)油脫蠟、梯度酒精水化。切片經(jīng)檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù)15 min，3%過(guò)氧化氫室溫孵育20 min 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，牛血清白蛋白封閉20 min，一抗孵育（RAP1A 按1 ∶200 稀釋?zhuān)珽PAC1 按1 ∶100 稀釋?zhuān)幮詫?duì)照用PBS 代替一抗）4℃冰箱過(guò)夜，37℃復(fù)溫45 min，清洗后加入二抗室溫孵育1 h。最后，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片后，倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

每張切片計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍鏡視野（×40），染色結(jié)果判讀采用免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS），分別記錄染色強(qiáng)度（SI）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比（PP）。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒，每次閱片時(shí)需保證白平衡、亮度等參數(shù)設(shè)置一致。根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)弱將染色強(qiáng)度分為4 個(gè)等級(jí)：0 分為陰性，1 分為弱陽(yáng)性，2 分為中度陽(yáng)性，3 分為強(qiáng)陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比分為5 個(gè)等級(jí)：0 分，＜5%；1 分，5% ～25%；2 分，＞25% ～50%；3 分，＞50%～75%；4 分，＞75%。最后計(jì)算IRS 值，IRS=SI×PP，獲得組織染色半定量評(píng)分。IRS 為0 ～12 分，IRS ≤3 分定義為低表達(dá)，IRS＞3 分定義為高表達(dá)。

1.4 Western blotting 檢測(cè)

組織剪碎后加入RIPA 裂解液，置于冰上裂解，離心后提取總蛋白；用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度；將蛋白溶液按照4 ∶1 的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性；取50 μg 總蛋白行SDSPAGE 電泳；恒壓100 V 轉(zhuǎn)膜1 h；5%脫脂牛奶封閉1 h；1 ∶1 000 稀釋RAP1A 一抗，1 ∶1 000 稀釋EPAC1 一抗，1 ∶1 000 稀釋GAPDH 一抗，4℃孵育過(guò)夜；在室溫下用TBST 洗膜3 次，加入1 ∶3 000稀釋的二抗，于搖床上室溫孵育1.5 h；用TBST 洗膜3 次，加入ECL 溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，曝光，最后顯影和定影。保存圖片并用Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組內(nèi)膜RAP1A 的表達(dá)

RAP1A 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜，在在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖1）。免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為（5.688±0.651）分、（8.700±1.144）分、（0.787±0.053）分，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.005，P=0.009）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜的IRS 水平均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖2）。

2.2 各組內(nèi)膜EPAC1 的表達(dá)

圖1 RAP1A 在各組內(nèi)膜的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×40）

圖2 RAP1A 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 （±s）

EPAC1 在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有表達(dá)；其在異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜，在腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（見(jiàn)圖3）。免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分顯示，異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的IRS 分別為（8.100±1.153）分、（8.878±1.829）分、（2.520±0.138）分，3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.850，P=0.002）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖4）。

2.3 各組內(nèi)膜RAP1A 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

RAP1A 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.518±0.059）、（0.479±0.381）、（0.177±0.012），3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.664，P=0.006）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

2.4 各組內(nèi)膜EPAC1 蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

EPAC1 在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.813±0.067）、（0.829±0.052）及（0.228±0.041），3 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.069，P=0.005）；異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜均高于正常內(nèi)膜（P＜0.05）；異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖3 EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×40）

圖4 EPAC1 在各組內(nèi)膜的IRS 比較 （±s）

圖5 各組內(nèi)膜中RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)

2.5 RAP1A 和EPAC1 表達(dá)的相關(guān)性

采用Pearson 法對(duì)RAP1A 和EPAC1 在各組內(nèi)膜的表達(dá)分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)在異位內(nèi)膜（r=0.635，P=0.033）和在位內(nèi)膜（r=0.697，P=0.005）及正常內(nèi)膜（r=0.436，P=0.018）均呈正相關(guān)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的常見(jiàn)病，在育齡期長(zhǎng)期處于活躍狀態(tài)，由于發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前臨床尚缺乏針對(duì)性的、長(zhǎng)期有效的生物治療手段。尋找在子宮內(nèi)膜異位癥差異表達(dá)的分子，探索可能的治療生物靶點(diǎn)，具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的表達(dá)升高，表明其可能參與疾病的發(fā)病過(guò)程。

RAP1A 通過(guò)調(diào)控多種分子信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。RAP1A 通過(guò)激活ERK/MAPK/Notch 信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。RAP1A 基因多態(tài)性導(dǎo)致肝移植后肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高[6]。LI 等[9]通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAP1A 可通過(guò)激活A(yù)kt 信號(hào)通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺激細(xì)胞遷移和侵襲，從而促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移。LIU等[15]發(fā)現(xiàn)RAP1A 在結(jié)直腸癌高表達(dá)，并揭示其通過(guò)激活PTEN/FOXO3/CCND1 通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲。劉立果[16]發(fā)現(xiàn)RAP1A 可通過(guò)PTEN/FOXO3/CCND1信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并通過(guò)臨床回顧分析發(fā)現(xiàn)RAP1A 可作為結(jié)直腸癌患者總體生存的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞敲除RAP1A 后，癌細(xì)胞的增殖、黏附和侵襲能力下降[17]。上述研究表明，RAP1A在細(xì)胞增殖、侵襲、黏附等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RAP1A 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)高于正常內(nèi)膜，提示RAP1A 可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的細(xì)胞增殖、侵襲、黏附等過(guò)程。有趣的是，孫樹(shù)凱等[18]發(fā)現(xiàn)脊髓神經(jīng)損傷小鼠的RAP1A 表達(dá)升高，機(jī)械痛閾明顯降低，而脊髓組織分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬標(biāo)志分子表達(dá)及自噬水平均升高，表明RAP1A 高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展，該過(guò)程可能與RAP1A 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，筆者推測(cè)，RAP1A 在子宮內(nèi)膜異位癥高表達(dá)，不僅參與疾病的發(fā)生過(guò)程，還可能通過(guò)自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生過(guò)程，后續(xù)進(jìn)一步研究RAP1A 及自噬在子宮內(nèi)膜異位癥的作用將可能揭示發(fā)生痛經(jīng)的新機(jī)制。

EPAC1 是細(xì)胞內(nèi)一種非依賴(lài)PKA 的介導(dǎo)cAMP 效應(yīng)的重要分子，在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮核心作用[19-20]。EPAC1 可活化鳥(niǎo)苷三磷酸酶，促進(jìn)RAP1A 結(jié)合鳥(niǎo)苷三磷酸變成活化形式。EPAC1基因缺失在體外抑制微血管形成，在病理性血管生成的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。EPAC1-RAP1A-NHE3通路可能調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)腎小管間質(zhì)炎癥發(fā)生[21]。在結(jié)直腸癌中，EPAC1 呈高表達(dá)，且對(duì)評(píng)估患者預(yù)后具有重要價(jià)值[22]。近年來(lái)，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)EPAC1 激活可能引起痛覺(jué)受體過(guò)敏，從而導(dǎo)致機(jī)體疼痛發(fā)生[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的表達(dá)高于正常內(nèi)膜，推測(cè)其可能通過(guò)促進(jìn)腹腔子宮內(nèi)膜異位癥病灶新生微血管生成參與子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，EPAC1 與RAP1A 的表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)兩者可能相互協(xié)同，共同促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、侵襲和黏附過(guò)程。最近研究表明[25]，炎癥在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，EPAC1 高表達(dá)也可能通過(guò)促進(jìn)炎癥過(guò)程而參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展。子宮內(nèi)膜異位癥引起疼痛的確切機(jī)制尚不清楚，RAP1A 及EPAC1兩者高表達(dá)，可能協(xié)同參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的慢性疼痛。

在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制研究中，“經(jīng)血逆流種植學(xué)說(shuō)”是最早被廣泛接受的學(xué)說(shuō)，活性的子宮在位內(nèi)膜通過(guò)輸卵管逆流到腹腔，在腹腔環(huán)境下，需經(jīng)過(guò)黏附、侵襲和血管形成才能在腹膜或卵巢等盆腹腔形成異位病灶。在該過(guò)程中，在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)特征起重要作用，決定了異位內(nèi)膜的生物學(xué)行為，這就是郎景和院士提出的經(jīng)典的“在位內(nèi)膜決定論”[26]。本研究中，異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜RAP1A 和EPAC1 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明兩者在異位內(nèi)膜與在位內(nèi)膜的表達(dá)均具有相似的特征，進(jìn)一步證實(shí)在位內(nèi)膜是子宮內(nèi)膜異位癥的根源，符合“在位內(nèi)膜決定論”學(xué)說(shuō)。由此可見(jiàn)，RAP1A 和EPAC1 可能成為子宮內(nèi)膜異位癥潛在的分子診斷和治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜中高表達(dá)，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)RAP1A 和EPAC1 可能相互協(xié)同，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展及痛經(jīng)的調(diào)控過(guò)程。EPAC1 表達(dá)升高，可能加速置換鳥(niǎo)苷三磷酸，促進(jìn)RAP1A 激活，進(jìn)而增強(qiáng)在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附及新生微血管形成能力，還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與痛經(jīng)的發(fā)生發(fā)展。本研究為進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制及探索可能的治療新靶點(diǎn)提供了思路。