王春利 王志高 王一凡 余新威 羅紅宇*

（1 浙江省海產(chǎn)品健康危害因素關(guān)鍵技術(shù)研究重點實驗室 浙江海洋大學 浙江舟山316022 2 舟山市疾病預防控制中心 浙江舟山316021）

隨著近年生命科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究證實人體的健康不僅與自身的基因有關(guān)，還與其腸道中微生物有著重要聯(lián)系。人體腸道菌群的編碼基因組被看作人體的第二基因組，人體自身基因的表達與腸道微生物相互協(xié)調(diào)、和諧一致，共同影響著人體的營養(yǎng)攝入、代謝和免疫的調(diào)控。到目前為止，眾多對腸道菌群的研究證明，其通過影響宿主的代謝顯型、營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生和吸收[1]以及改善和調(diào)整機體的免疫功能[2]，進而影響機體的健康狀況。腸道內(nèi)菌群的動態(tài)平衡若被打破則會導致人體功能紊亂，從而引發(fā)各類疾病。生物活性肽具有多種理化性質(zhì)，對多種代謝途徑和生理環(huán)境起著積極作用，腸道菌群作為體內(nèi)代謝活動的一部分，生物活性肽對此有著重要的影響，如乳源生物活性肽（MDBPs）主要是通過蛋白酶水解乳汁中的乳清蛋白和酪蛋白（casein，CN）或者微生物發(fā)酵乳制品制備得到的小分子肽段，這種小分子肽不僅可以促進腸道對于營養(yǎng)物質(zhì)吸收，促進腸道免疫細胞增殖和增強巨噬細胞吞噬作用，還可以緩解斷奶或腸炎引發(fā)的氧化應激反應，同時對于抑制腸道有害致病菌，改善腸道微生態(tài)環(huán)境均有一定的功效[3]。近年來，抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs） 作為飼用抗生素替代品的研究與應用成為飼料添加劑研究熱點之一。翟少偉等[4]在飼料中添加抗菌肽Surfactin，可提高吉富羅非魚腸道皺襞高度，調(diào)節(jié)腸道菌群，提高腸道抗氧化能力，從而改善吉富羅非魚腸道健康狀態(tài)。印虹等[5]研究表明生物活性肽對腸道SIgA 有一定促分泌作用，同時能夠增加腸絨毛長度，改善腸黏膜結(jié)構(gòu)，因而在促進腸黏膜免疫，改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)，減少腸道有害菌群數(shù)量和增強腸道生物屏障方面具有積極作用。伴大豆球蛋白酶解肽是模擬人體腸道環(huán)境，用胃蛋白酶水解大豆蛋白所得產(chǎn)物。左偉勇[6]推測，伴大豆球蛋白酶解肽不僅能促進體內(nèi)雙歧桿菌的增殖，而且對機體黏膜免疫功能也有一定的作用。楊玉榮[7]用大豆活性肽飼喂的肉雞的腸道黏膜消化吸收功能增強，在肉雞生長過程中，大豆活性肽提高肉雞腸道有益菌/有害菌的比值，且高于抗生素組，驗證了大豆活性肽可以改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)。在其它研究中也發(fā)現(xiàn)大豆活性肽能夠提高肉雞的生產(chǎn)性能[8]。在哺乳仔豬日糧中添加一定量植物活性肽，能夠大大增強大腸內(nèi)乳酸菌等有益菌群的繁殖，有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌群的繁殖[9]。

高F 值寡肽是由2～9 個氨基酸殘基所組成且支鏈氨基酸與芳香族氨基酸比值大于20 的一種混合肽，其獨特的氨基酸構(gòu)成、生理調(diào)節(jié)功能和易消化吸收等諸多優(yōu)點，成為近年來保健和醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點。對高F 值寡肽的研究多集中在制備及體外活性方面，而其在消化吸收過程中對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響未見報道。

課題組前期利用水產(chǎn)加工下腳料制備了高F值寡肽，通過分離純化得到5 個寡肽單體，并測定了寡肽的氨基酸序列。通過分析選取其中的兩個寡肽M2、M3 進行合成。本文采用合成的兩個寡肽灌胃小鼠，分析其腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。目的是探究高F 值寡肽調(diào)控小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，找出其顯著干預的關(guān)鍵菌屬，為高F 值寡肽及相關(guān)的益生菌制劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高F 值寡肽M2（Leu-Leu-Asp-Val-Tyr；）、M3 （Leu-Leu-Phe-Thr-Thr-Gln；）（純度大于95%），由上海波泰生物科技有限公司合成；DNA 快速提取試劑盒，杭州榮邦生物科技有限公司；硫酸葡聚糖（Dextran sulfate sodium，36 000～50 000，MPBiomeidcals 公司；白細胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒，舟山市新城科博實驗儀器有限公司。

1.1.2 實驗動物 清潔級Balb/c 小鼠，7 周齡，雄性，體重18～23 g，購于浙江省實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房中，溫度（24±1） °C，12 h 光照/黑暗循環(huán)，動物飼養(yǎng)使用標準鼠糧和水。所有動物實驗按照浙江海洋大學動物倫理委員會有關(guān)規(guī)定進行。

1.2 主要設(shè)備與儀器

日立CR21G 型高速離心機，日本日立公司；HHS 型恒溫水浴鍋，上海迅播實業(yè)有限公司；Nano Drop2000，Thermo Fisher Scientific 公司；BT125D 型電子天平，塞利多斯科學儀器有限公司；THERMO 酶標儀，上海輔澤商貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

將40 只小鼠進行1 周的適應性喂養(yǎng)后，挑選身高、體重相近，精力旺盛的小鼠，按每組10 只隨機分為3 組，分別命名為M2 組、M3 組與空白組。在正常飲食的基礎(chǔ)上，每天18：00 對各組小鼠分別灌胃M2、M3 及等量的水，灌胃量均為0.1 mL／小鼠，具體灌胃方案見表1。1 周后處死小鼠，收集腸道內(nèi)容物并提取腸道菌群DNA。用nano drop2000 微量紫外分光光度法檢測提取的DNA濃度。抽取每組濃度最高的5 個樣品進行16s rRNA 測序，相似性分析（Anosim）、韋恩圖（OTUvenn）、從主成分分析 （OUT PCA）、主坐標分析（PCoA）、組間群落差異分析（LDA EffectSize）。

表1 小鼠的分組及給藥方案Table 1 Grouping of mice and dosing regimen

2 試驗結(jié)果

2.1 樣品組成的組間及組內(nèi)差異分析

Anosim 分析是利用R 參數(shù)值檢測組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，若R 大于0，說明組間差異大于組內(nèi)差異，且P 值越小組間差異越大。PCoA 分析是通過UniFrac 算法計算樣品兩兩間的距離，樣品間距離越近，兩個樣品的組成越相近，也可反映各樣品間差異的大小。

試驗樣品的Anosim 分析如圖1所示。R 值為0.491，P 值為0.001，遠小于0.05，說明3 組小鼠腸道菌群組成差異極其顯著，且組間差異遠大于組內(nèi)差異，分組是成功的。

試驗樣品的PCoA 分析如圖2所示。A、B 兩組樣品集中分布在圖的左中央，樣品兩兩間距離較近，然而，同組樣品間距離小于組間樣品距離；空白組樣品主要分布于圖的右側(cè)區(qū)域，5 個樣品間距離較遠。由此說明，A、B 兩組樣品組內(nèi)組成相似，而組間存在差異。兩個寡肽組與空白組樣品的差異極顯著，和用Anosim 分析的結(jié)論一致。圖1中A 組有一個樣品與B 組的一個樣品間距太小以至于重合，可能是因個體差異所致的偶然誤差。

圖1 Unweighted unifrac anosim 分析得到各組小鼠腸道菌群的分布圖Fig.1 Distribution map of the intestinal flora of each group of mice obtained from the analysis of Unweighted unifrac anosim

圖2 Unweighted unifrac PcoA 分析得到的3 組小鼠腸道菌群分布圖Fig.2 Distribution map of the intestinal flora of three groups of mice obtained from the analysis of unweighted unifrac anosim

2.2 樣品的物種組成分析

2.2.1 OTU Venn 圖分析 OTU Venn 圖分析是基于高通量測序獲得的序列相似度進行歸類分析的，序列相似度大于97%的reads 劃分為同一個OTU，視為一個微生物物種，否則劃分為新的OTU。OTU 代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對，可獲得對應樣品的物種信息，并判斷組間共有或特有的OTU[10]。本試驗的OTU 代表序列混合聚類結(jié)果，如圖3所示。15 個樣品共得到931 個OTU，A 組有456 個OTU，6 個OTU 為特有；B 組450 個OTU，4 個OTU 為特有；C 組889 個OTU，430 個OTU為特有，3 組共享OTU 373 個，占總OTU 的40.1%。由此可知，灌胃寡肽后，小鼠腸道內(nèi)的原生菌群減少，腸道菌群的多樣性降低，說明高F 值寡肽可顯著改變小鼠腸道的菌落結(jié)構(gòu)，減少菌群多樣性的同時，激活某些腸道菌成為優(yōu)勢菌。

2.2.2 OTU PCA 分析 OTU PCA 分析是將不同樣品的OTU 差異以距離的形式反映在二維坐標軸上，以對樣品OTU 方差貢獻最大的前兩個特征值為坐標軸。該分析可反映組內(nèi)與組間的樣品分散和聚集的情況，從而評判相同條件下樣品OTU組成是否存在相似性[11]。樣品的距離越近，說明樣品微生物群落組成越相似。

圖3 各組小鼠腸道內(nèi)OTU Venn 圖分析Fig.3 Analysis of intestinal OTU venn plot in mice

3 組樣品和A、B 兩組樣品的OTU PCA 分析分別見圖4a、4b。因A、B 兩組OTU 組成相似，故圖中兩組間及組內(nèi)的樣品點均集中分布于坐標軸（-10，-10）附近區(qū)域，且樣品間的距離很近。A 組樣品點集中于左側(cè)上方區(qū)域，B 組樣品點集中于左側(cè)下方區(qū)域，表明兩組物種組成仍存在差異；而C 組平均分布于坐標軸（0～20，0～10）區(qū)域，且C 組與A、B 兩組OTU 組分差異較大，表現(xiàn)為組間樣品點與點之間的離散程度很大，同組內(nèi)的點離散度也較大。這與樣品分組的Anosim、OUT PCA 分析結(jié)論以及OTU Venn 圖分析結(jié)果是一致的。

圖4 樣品的OUT PCA 分析Fig.4 OUT PCA analysis of samples

2.3 物種豐度分析

根據(jù)3 組樣品的測序結(jié)果，繪制門、科水平上腸道菌群中各物種的相對豐度柱狀圖 （圖5、圖6），其中不同顏色代表不同菌屬，色塊長度代表其相對豐度比例。從圖5和圖6中反映不同分類等級中各組豐度較高物種及其比例，

對門水平上的物種豐度分析顯示：擬桿菌門和硬壁菌門所占比例在3 組的豐度中均位列第一、第二，兩門的總量在A、B、C 組3 組中分別為90.17%，91.73 和88.20%；A、B 組中豐度較高的菌屬都是變形菌門和柔膜菌門，兩門所占比例在A組中分別為5.83%和3.48%，在B 組中分別為4.00%和3.65%，而C 組中豐度較高的僅有變形菌門，所占比例為10.64%。

圖5 小鼠腸道菌群在門水平上的組成Fig.5 Phylum level barplot of intestinal flora in mice

圖6 小鼠腸道菌群在科水平上的組成Fig.6 Family level barplot of intestinal flora in mice

對科水平上的物種多樣性分析顯示：3 組樣品豐度排名前5 的分別為紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、理研菌科 （Rikenellaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和擬桿菌科（Bacteroidaceae），5 類菌總量均超過80%，屬于3 組中的優(yōu)勢菌。然而，同一類菌所占比例存在組間差異，C 組紫單胞菌科含量為46.47%，占絕對優(yōu)勢，顯著高于A、B 組中的含量。A、B 兩組紫單胞菌科和毛螺菌科含量相近，且兩組中毛螺菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科總量明顯高于C 組。A、B、C 3 組中擬桿菌科所占比例相似（表2）。

表2 科水平上小鼠腸道菌種的含量分布Table 2 Content distribution of intestinal flora in mice at the level of family

2.4 LDA EffectSize（LefSe）組間群落差異分析

LefSe 分析可顯示不同組中豐度有顯著差異的物種，柱狀圖的長度代表顯著差異物種的影響程度，進化分支圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表從界到屬的分類級別，黃色表示無顯著差異的物種，差異物種用分組顏色表示。因菌種對腸道菌群的影響主要體現(xiàn)在科、屬水平上，故探討各組樣品于科、屬水平上的特有菌種。如圖7所示，綠色、紅色和藍色分別代表空白組、M3 寡肽組和M2 寡肽組含量具有明顯差異的菌種?？瞻捉M的菌種最多，與前述的OTU venn 的分析一致。M2 寡肽組的特有菌種主要為無形小體科（Anaeroplasmataceae），M3寡肽組的特有菌種為理研菌科、另枝菌屬（Alistipes）和甲基桿菌科（Methylobacteriaceae），空白組的特有菌種為紫單胞菌科和莫拉菌科（Moraxellaceae）。

圖7 小鼠腸道菌群的LefSe 分析Fig.7 LefSe analysis of intestinal flora in mice

3 結(jié)論

通過Anosim 分析驗證樣品分組成功后，采用OTU PCA 和PCOA 分析A、B 兩組和C 組之間存在差異，而A、B 兩組的菌群差異較小，與C 組的菌群組成存在較大差異。

在門水平上進行物種豐度分析時發(fā)現(xiàn)，A、B兩組中擬桿菌門和硬壁菌門的總量分別為90.17%和91.73%，而C 組總量為88.20%。一般情況下，正常機體的擬桿菌門和硬壁菌門的總量大于90%[12]，這說明通過灌胃M2、M3 寡肽可以改善小鼠腸道菌群在門水平上的分布并趨于正常。在對小鼠生理活性影響較大的科水平分析來看，A、B 兩組相較于C 組存在大量的毛螺菌科、理研菌科和普雷沃氏菌科，而C 組比A、B 兩組存在更多的紫單胞菌科。有研究表明，毛螺菌科在腸道中分解氨基酸并將其轉(zhuǎn)換為腸道細胞的營養(yǎng)來源過程中起很大作用影；Dubin 等[13]在藥物對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人治療效果的研究發(fā)現(xiàn)，藥物治療后有些患者會患有腸炎，與沒有腸炎副反應的患者相比，其體內(nèi)的擬桿菌群，特別是理研菌科的含量顯著降低，據(jù)此推測理研菌科具有保護腸道，減少應激條件下發(fā)生腸炎的概率。劉蓉蓓[14]在對腹瀉主導的腸易刺激綜合癥（IBS）患者研究時發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬可能抑制腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂；紫單胞菌科是人體和動物腸道與口腔中的土著微生物，然而，紫單胞菌科中某些菌種會導致人或動物的感染[15]。如吳芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，牙周病炎癥患者口腔中比正常人的紫單胞菌屬顯著增加。由此推測，給小鼠灌胃M2、M3 寡肽可增加小鼠腸道中的有益菌，同時減少腸道有害菌，改善了小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)，保持健康的腸道微生態(tài)環(huán)境。

進一步分析各組小鼠腸道含量較高的特有菌時發(fā)現(xiàn)，M2 寡肽組的優(yōu)勢特有菌為無形小體科。Kawahara[17]在對日本野生小鼠及蜱蟲體內(nèi)分離出的無形小體科分析時發(fā)現(xiàn)，無形小體科屬于小鼠及蜱蟲內(nèi)常駐菌，當人體被帶有無形小體科的小鼠或蜱蟲叮咬后導致人粒細胞無形體?。℉GA）的發(fā)生。M3 寡肽組的優(yōu)勢特有菌為理研菌科、另枝菌屬和甲基桿菌科，理研菌科具有預防腸炎，保護腸道的功能。目前另枝菌屬的功效尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，隨著季節(jié)變換，森林姬鼠（Apodemusdraco）食物由昆蟲轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锓N子時，另枝菌屬在森林姬鼠腸道內(nèi)的數(shù)量顯著提高[18]。據(jù)此推測另枝菌屬的增加可能是為了適應食物來源的改變，具有某種特定消化功能，對機體無害；甲基桿菌是一類產(chǎn)紅色色素、特異性甲基營養(yǎng)型細菌，不僅可以水解淀粉，而且除利用果糖外還有獨特的碳源利用特性[19]。空白組的優(yōu)勢特有菌為紫單胞菌科和莫拉菌科，莫拉氏菌為人和動物器官黏膜中的常駐菌，屬條件致病菌，損害機體免疫而導致支氣管、肺部的感染[20]。近年來對不液化莫拉氏菌所引發(fā)的敗血癥報道較多。

綜上分析，本文研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠灌胃高F 值寡肽單體M2、M3，可以明顯改變小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)。與空白組相比，雖然腸道菌群的多樣性下降，但是小鼠腸道菌群中益生菌相對增加，并成為優(yōu)勢菌，特別是灌胃M3 寡肽組的小鼠腸道優(yōu)勢菌和特有菌對防病治病都顯示一定的功效。后續(xù)將研究高F 值寡肽M3 在抗炎方面的活性。