隋 新，李 鵬，謝 洋，付 東，張曉臣

（黑龍江省科學(xué)院 高技術(shù)研究院，黑龍江 哈爾濱150020）

馬勃（Lasiosphaera Calvatia）別名灰包、馬糞包，是一類擔(dān)子菌門的真菌通稱，始載于《名醫(yī)別錄》，其干燥子實(shí)體可入中藥，具有止血、抗菌、抗癌等功效，臨床上用于多種出血性疾病，如口腔出血、消化道出血及外傷出血等。自20世紀(jì)60年代以來，由于馬勃特殊的藥理作用，使其倍受醫(yī)藥界的關(guān)注。中國(guó)藥典2005版規(guī)定灰包科脫皮馬勃、大馬勃和紫色馬勃的干燥子實(shí)體做為藥用馬勃正品[1]。馬勃藥材在我國(guó)資源豐富，生于曠野草地，產(chǎn)于內(nèi)蒙、遼寧、安徽、甘肅、江蘇、云南等地區(qū)[2]。

盡管馬勃具有較好的藥理作用[3-6]，但大部分研究?jī)H僅是對(duì)其中所含的化合物進(jìn)行提取分離，雖然從中得到了不少種類的化合物，現(xiàn)已證實(shí)的有氨基酸[7]、甾類化合物[8]、萜類化合物[9]、馬勃多糖[10]、多肽和蛋白質(zhì)[11,12]，還有一些其它成分如微量元素等，但是對(duì)其化合物的藥理活性研究較少。因此，本文利用活性物追蹤分離的方式，采用體外凝血實(shí)驗(yàn)，利用加熱回流提取、有機(jī)溶劑萃取等方式對(duì)馬勃中止血活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，最終得到止血活性部位，此研究將為新型藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為馬勃資源的合理利用及藥用部位的確定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

QE-200型高速萬能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；EYEL4型平行反應(yīng)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-2型凍干機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；K61型秒表（上海星鉆秒表有限公司）；CS501-SP型水浴鍋（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器廠）；6孔白陶瓷板（上海壘固儀器有限公司）。

95%乙醇（AR西隴化工股份有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（吉林省廣春藥業(yè)有限公司）；蒸餾水（自制）。

健康實(shí)驗(yàn)用哈長(zhǎng)耳白兔（體質(zhì)量2.0～2.5kg，雄性，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；云南白藥（云南白藥股份有限公司，規(guī)格：4g，批號(hào)：ZDA1602，購(gòu)于哈爾濱聯(lián)想億百大藥房連鎖有限公司）；馬勃藥材購(gòu)于南極藥材批發(fā)市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 取馬勃干燥藥材適量，用粉碎機(jī)粉碎，溶劑為水、45%乙醇、95%乙醇，固液比1∶15，加熱回流提取3次，每次2h，提取結(jié)束后過濾得上清液，合并濾液，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得固形物，稱重，計(jì)算得率。

1.2.2 萃取方法 按照1.2.1項(xiàng)下提取方法將提取液濃縮至無醇味時(shí)停止，按照提取液與溶劑比例為1∶1，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同萃取層，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得固形物，稱重，計(jì)算得率。

1.2.3 體外凝血實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 瓷板針挑法 在白瓷板的凹坑內(nèi)，分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，再分別加入CaCl2溶液0.1mL，用大頭針把藥液與CaCl2溶液混勻，最后分別同時(shí)加入抗凝血液0.5mL，立即計(jì)時(shí)，迅速用大頭針攪拌混勻且攪拌次數(shù)一致。以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。以后每30s用大頭針穿過血液輕挑1次，當(dāng)出現(xiàn)血絲時(shí)為開始凝血，當(dāng)推動(dòng)血塊時(shí)，露出瓷板白底即算血液完全凝固。從加入抗凝血液到血液完全凝固時(shí)間為凝血時(shí)間。

1.2.3.2 試管法 取內(nèi)徑為8mm，長(zhǎng)10cm的玻璃潔凈試管，每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，再加入CaCl2溶液0.1mL，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，然后于各管內(nèi)同時(shí)加入兔血0.5mL，以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照，蓋緊，倒轉(zhuǎn)3次，立即計(jì)時(shí)，在37℃的水浴箱中觀察，每隔30s輕輕傾斜試管1次，角度為30°，觀察血液是否流動(dòng)，直至傾斜到90°血液不再流動(dòng)而完全凝固于試管底為止，即為凝血時(shí)間。

1.2.3.3 復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定 取內(nèi)徑為8mm，長(zhǎng)10cm的潔凈玻璃試管，每管分別加入濃度為5mg·mL-1樣品0.1mL，加入的CaCl2溶液0.1mL，搖勻，在37℃水浴溫浴1min，再于各管內(nèi)同時(shí)加入0.1mL的血漿，同時(shí)開動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，每隔15s傾斜試管1次，在混合液中開始出現(xiàn)彌漫的白色顆粒纖維蛋白絲時(shí)，即為復(fù)鈣時(shí)間。以云南白藥為陽性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，若P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 活性提取物的確定

采用不同濃度（v/v）乙醇對(duì)馬勃活性物進(jìn)行提取，得到3種提取物，分別為馬勃水提取物、45%乙醇提取物及95%乙醇提取物，得率見圖1。

圖1 馬勃各提取物得率對(duì)比Fig.1 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extract

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度的升高，活性物得率也在增加。得率的增加可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁咂茐恼婢?xì)胞壁的能力越強(qiáng)，使可溶性物質(zhì)溶出。

分別采用瓷板針挑法、試管法和復(fù)鈣時(shí)間對(duì)3種馬勃提取物進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 馬勃各提取物體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果（瓷板針挑法、試管法、復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定）Fig.2 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extract in vitro

從圖2可以看出，馬勃各提取物與空白對(duì)照組對(duì)比均有不同程度的差異，可以表明馬勃提取物能有效的縮短血液凝聚時(shí)間，其中45%乙醇提取物體外凝血效果最佳，所以本實(shí)驗(yàn)選擇45%乙醇提取物進(jìn)一步分離，尋找止血活性部位。

2.2 活性部位的確定

通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選馬勃止血活性部位，由于45%乙醇提取物具有凝血活性，所以采用不同極性溶劑對(duì)其依次萃取，得率見圖3。

圖3 馬勃各萃取部位得率對(duì)比Fig.3 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction

從圖3中可以看出，隨著萃取溶劑極性的增強(qiáng)，得率也在增加。

馬勃不同萃取部位凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5種馬勃萃取物和云南白藥陽性對(duì)照組，與空白實(shí)驗(yàn)組相比均有不同程度的差異，說明馬勃各萃取部位均能有效的縮短血液凝聚時(shí)間。

圖4 馬勃各萃取部位體外凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果（瓷板針挑法、試管法、復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定）Fig.4 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction in vitro

從圖4可以看出，馬勃各萃取部位與空白對(duì)照組對(duì)比均有顯著性差異（p＜0.05），其中正丁醇部位具有較好的止血效果。

3 結(jié)論

本文通過活性物追蹤分離的方式，采用加熱回流法對(duì)馬勃活性物進(jìn)行提取，通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選出馬勃止血活性提取物；對(duì)此提取物通過液液萃取的方式從低極性到高極性依次萃取，進(jìn)一步通過體外凝血實(shí)驗(yàn)篩選出馬勃止血活性部位（正丁醇部位），這為以后活性成分的捕捉提供理論基礎(chǔ)。