徐靜 朱國(guó)慶 周義浪 王敏 孫麗娥 蔣梅
(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 貴陽(yáng) 550003)
魚(yú)腥草是一類在東南亞地區(qū)或國(guó)內(nèi)南方地區(qū)大規(guī)模生長(zhǎng)的三白草科蕺菜,其主要功效為:清熱解毒、利尿通淋等。有研究者對(duì)魚(yú)腥草的藥理作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)腥草除上述作用外,還有抗菌消炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。黃酮類化合物是一類多酚化合物,在多類植物中都廣泛存在,能夠阻礙細(xì)胞的增殖,對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo),同時(shí)還可對(duì)抑癌基因的活性產(chǎn)生加強(qiáng)作用,并對(duì)癌基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用[2]。本研究在研究開(kāi)始前,對(duì)魚(yú)腥草總黃酮化合物的成分和含量進(jìn)行檢測(cè)和分析,并在此基礎(chǔ)上圍繞其對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的阻抑作用進(jìn)行研究,期望對(duì)魚(yú)腥草的抗癌作用機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)闡述,為魚(yú)腥草在臨床抗腫瘤的實(shí)際運(yùn)用中提供參考。
本研究于2016年8月在貴陽(yáng)市百宜鄉(xiāng)和遵義市的新浦區(qū)魚(yú)腥草種植基地內(nèi)選取本研究所用的新鮮魚(yú)腥草的根和葉。送至貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院進(jìn)行鑒定,確定本研究所采取的魚(yú)腥草是三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草。
本研究使用的試劑有:二甲基亞砜(DMSO)(由江西洪瑞生物技術(shù)有限公司提供)、四甲基偶氮唑藍(lán)干粉(同上)、碘化丙啶(同上)。AnnexinV-FITC/FITC雙染試劑盒(同上)。蘆丁是本研究自行配制的,其濃度>98%。AB-8型大孔吸附樹(shù)脂由天津南開(kāi)大學(xué)化工廠提供。
人肝癌細(xì)胞BEL-7402由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。
對(duì)粗提取物進(jìn)行稱量,將適量的黃酮提取物放入無(wú)血清培養(yǎng)基中溶解,配制濃度為6.4g/L的母液,使用規(guī)格為0.22μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾,然后將其封存放置于溫度為4℃的環(huán)境中留存?zhèn)溆谩?/p>
將人肝癌細(xì)胞BEL-7402放置在無(wú)菌DMEM細(xì)胞發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)擰培養(yǎng),并將其放置在環(huán)境溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3天左右的時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一次傳代,選取生長(zhǎng)期為對(duì)數(shù)的細(xì)胞作為本研究的樣本細(xì)胞。
運(yùn)用DMEM培養(yǎng)液,對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402進(jìn)行稀釋,配制成0.5×108L-1的細(xì)胞懸液,并在96孔板上進(jìn)行接種,各孔均有100μL的培養(yǎng)液和5000個(gè)細(xì)胞,將其放置在環(huán)境溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后,將濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L的魚(yú)腥草總黃酮化合物分別加入到培養(yǎng)板中,各個(gè)濃度水平的藥物均設(shè)置了3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置不添加任何藥物的細(xì)胞以及添加溶劑的細(xì)胞作為對(duì)照組,同時(shí)還設(shè)置調(diào)零孔,將其放置在環(huán)境溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),時(shí)間為48小時(shí)。
運(yùn)用AnnexinV/P I雙染-流式檢測(cè)方法,對(duì)細(xì)胞凋亡的水平進(jìn)行檢測(cè)。在6孔板中,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于此,人肝癌細(xì)胞BEL-7402的濃度水平是2.5×108L-1,各孔的接種量為2ml,將其放置在環(huán)境溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁以后,吸取培養(yǎng)液后放棄,將藥物濃度為0.5g/L、0.8g/L、2.0g/L的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液分別加入其中,并設(shè)置對(duì)照孔,繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),時(shí)間為48小時(shí)。
MTT結(jié)果顯示,魚(yú)腥草總黃酮化合物的濃度為0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L時(shí),會(huì)以濃度依賴性的形式,對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖產(chǎn)生阻抑作用,且魚(yú)腥草總黃酮化合物的濃度越大,抑制水平越高。
AnnexinV/P I雙染-流式檢測(cè)結(jié)果顯示,魚(yú)腥草總黃酮化合物發(fā)揮藥效后,當(dāng)濃度為0.5g/L、0.8g/L,且作用48小時(shí)后,細(xì)胞凋亡的數(shù)量在一定程度上升,當(dāng)濃度達(dá)到2.0g/L時(shí),細(xì)胞凋亡水平達(dá)到最大值,總細(xì)胞凋亡水平為89.7%。其中在添加藥物的組中,早期凋亡的細(xì)胞水平在一定程度上有所增加。
臨床醫(yī)學(xué)認(rèn)為,魚(yú)腥草能夠清肺化痰,同時(shí)還能夠治療白血病、抵抗癌細(xì)胞和氧化放映。本研究開(kāi)展前,曾通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),在魚(yú)腥草中,含有黃酮、生物堿等成分,且發(fā)現(xiàn)部分以魚(yú)腥草為主要藥材的藥品,如先魚(yú)湯、參慈膠囊等,可對(duì)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生阻抑作用,效果十分理想。黃酮類化合物是一類多酚化合物,在多類植物中均可檢測(cè)出該物質(zhì),其潛在的藥用價(jià)值較高,目前臨床研究者熱衷于對(duì)其抗腫瘤的作用進(jìn)行研究。本研究運(yùn)用魚(yú)腥草總黃酮化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的抑制作用進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,在人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)過(guò)程中,魚(yú)腥草總黃酮提取物可發(fā)揮顯著的阻抑作用,依據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置不同濃度水平的藥物組,運(yùn)用流式細(xì)胞儀,對(duì)魚(yú)腥草總黃酮化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)的影響進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果顯示,在人肝癌細(xì)胞BEL-7402的生長(zhǎng)過(guò)程中,魚(yú)腥草總黃酮化合物能夠阻抑作用。
綜上所述,在人肝癌細(xì)胞BEL-7402生長(zhǎng)中,魚(yú)腥草總黃酮提取物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖。