趙 琳

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215000)

女性在40歲以前出現(xiàn)的卵巢功能減退稱為早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，其終末階段為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，主要特征為閉經(jīng)、FSH>40 IU/L、雌激素水平降低并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀以及不孕。30～40歲女性發(fā)病率約為1%左右，近年來呈上升趨勢[1]。其病因多種多樣，其中37%的POF因手術(shù)及放化療損傷等醫(yī)源性因素引起，而遺傳、代謝、免疫、環(huán)境及氧化應(yīng)激等也與該病相關(guān)，不良生活方式、工作方式也為其誘因。其主要的治療方法為激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)，然而HRT僅能緩解圍絕經(jīng)期癥狀，無法從根本上挽救早衰的卵巢，且長期外源性激素的作用下可增加血栓性疾病及腫瘤等相關(guān)疾病的發(fā)病率。而對于不孕的患者目前只能通過凍存卵細胞、“贈卵”、胚胎移植等方式解決生育問題。近年來隨著再生醫(yī)學研究快速發(fā)展，干細胞作為一類具有多向分化潛能和自我復制能力強的原始未分化細胞，自上個世紀被發(fā)現(xiàn)之后逐漸走入大家的視野。由于干細胞的全能特性，干細胞移植在包括不孕癥等多種復雜疾病的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，因前者來源困難且存在較多的倫理爭議，其相關(guān)研究受到極大限制。而間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作為一種成體干細胞不僅有干細胞的特性且來源廣泛，倫理爭議較少，在POF的治療上有著巨大的潛力。本文主要對MSCs治療POF的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 MSCs概述

MSCs作為最早在骨髓中被發(fā)現(xiàn)的一種成體干細胞，起源于中胚層，幾乎在全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中均有分布[2]。它不僅保持著干細胞多向分化的潛能，而且免疫原性低，向受損組織遷移能力強，倫理爭議較小，因此最早被應(yīng)用于臨床研究，現(xiàn)已廣泛用于醫(yī)學生物工程。目前， MSCs已經(jīng)用于治療血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、運動系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及皮膚等多種系統(tǒng)的相關(guān)疾病，療效頗佳[3]?；谶@種基礎(chǔ)， MSCs用于包括POF在內(nèi)的生殖系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)及臨床研究也在有條不紊的開展中，并證實了MSCs的有效性。研究用于治療POF的MSCs主要包括骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)、臍帶間充質(zhì)干細胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)、胎盤間充質(zhì)干細胞(placental mesenchymal stem cells，PMSCs)、羊膜間充質(zhì)干細胞(amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs)、羊水間充質(zhì)干細胞(amniotic fluid mesenchymal stem cells，AFMSCs)、經(jīng)血間充質(zhì)干細胞(menstrual stem cells, MenSCs)、脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSCs)等胎兒來源或是成體來源的MSCs，并且已經(jīng)取得令人矚目的結(jié)果。盡管不同來源的MSCs可能有不同的生物學特性，但總的來說它們治療POF的機制可以總結(jié)為以下幾點：(1)MSCs具有“歸巢”作用；(2)MSCs能直接分化為顆粒細胞或者是抑制其凋亡，促進其再生，改善其功能；(3)MSCs可誘導、分化為原始生殖細胞；(4)MSCs可促進卵巢血管的生成；(5)MSCs有免疫調(diào)節(jié)作用[4]；(6)MSCs能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]。這些直接或間接的作用使MSCs治療POF成為可能。

2 MSCs與顆粒細胞

卵巢顆粒細胞(ovarian granulosa cells，OGCs)是卵巢主要的功能細胞，它通過自分泌和旁分泌的機制在卵泡的各個階段起到舉足輕重的作用。各種原因造成的顆粒細胞異常均能夠?qū)е录に胤置诋惓?、卵泡發(fā)育障礙甚至引起卵泡閉鎖。研究表明化療可通過損害顆粒細胞DNA，激活顆粒細胞凋亡通路等機制促進顆粒細胞凋亡從而導致POF的發(fā)生[6]。因此認為，抑制顆粒細胞凋亡，促進顆粒細胞生成或者增強顆粒細胞功能能夠有效預(yù)防POF，而MSCs的多向分化潛能可能可以實現(xiàn)這種假設(shè)。10余年前國外學者通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在特定培養(yǎng)條件下顆粒細胞分泌功能可降低并能夠產(chǎn)生干細胞的標志物，分化形成神經(jīng)細胞、骨和軟骨等各項不同組織的細胞，表明顆粒細胞存在干細胞的潛力[7]。此后，大量研究均表明顆粒細胞與包括BMSCs、UCMSCs在內(nèi)的多種MSCs均存在大量相同或相似的表面標志物[8-9]。一項動物研究表明，原位注射MenSCs后，MenSCs可被誘導分化為卵巢顆粒細胞，POF小鼠的卵巢重量、雌激素水平和正常卵泡的數(shù)量增加，F(xiàn)SH水平降低，卵巢功能明顯好轉(zhuǎn)[10]。另一項相似的動物研究表明，MenSCs治療后，POF小鼠卵巢功能明顯改善，通過標記MenSCs，發(fā)現(xiàn)該細胞主要定位在卵泡周圍顆粒細胞層，故認為 MenSCs可能被誘導分化為卵巢顆粒細胞，從而起到治療POF的作用[11]。由此推測顆粒細胞與MSCs之間在某種條件下可能可以相互轉(zhuǎn)化，深入的研究仍有待進一步探索。Fu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，體外將化學藥物損傷的顆粒細胞與BMSCs共培養(yǎng)時，BMSCs可以抑制顆粒細胞凋亡，上調(diào)Bcl2蛋白的表達，而將BMSCs移植入接受環(huán)磷酰胺注射的POF大鼠的卵巢中，通過動情周期變化和性激素水平評估卵巢功能，并通過TUNEL分析顆粒細胞凋亡，得到同樣結(jié)果，BMSCs可以通過抑制顆粒細胞凋亡改善卵巢功能。通過建立體外損傷模型，觀察到UMSCs外泌體可與損傷的OGCs結(jié)合，從而加速OGCs從順鉑體外誘導的應(yīng)激和凋亡中恢復，而這種機制可能與microRNAs 27，28相關(guān)[13]。與之相似，另一項羊水干細胞的實驗表明顆粒細胞凋亡的抑制可能與外泌體攜帶的miR-146a和miR-10a相關(guān)[14]。由此可見MSCs能通過抑制顆粒細胞的凋亡來改善POF，其機制可能與外泌體相關(guān)。有學者將AMSCs與自然衰老的顆粒細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顆粒細胞增殖率明顯增加，同時細胞表面 AMH、FSHR、FOXL2、CYP19A1的表達明顯增加，提示AMSCs 可能通過改善顆粒細胞的功能，促進顆粒細胞增殖阻止卵巢功能的減退[15]。另一項研究表明，AMSC高表達轉(zhuǎn)錄因子OCT4和Nanog，能通過JAK/STAT信號通路提高相關(guān)生長因子和趨化因子的表達，促進顆粒細胞增殖，恢復損傷卵巢功能[16]。因此，MSCs可通過各種途徑改善顆粒細胞功能從而達到恢復卵巢功能及治療POF的作用，可能與MSCs的多向分化潛能，外泌體的作用及自分泌或旁分泌能力相關(guān)，今后需在全面評估其安全性及可行性的基礎(chǔ)上，深入探討MSCs恢復顆粒細胞功能作用機制。

3 MSCs與原始生殖細胞

研究表明，MSCs能通過多種途徑激活原始生殖細胞，從而調(diào)節(jié)卵巢功能達到治療POF的目的，而其具體機制尚不清晰。既往動物研究表明，ADMSCs及UCMSCs可以直接被誘導分化為雄性原始生殖細胞，而CD61(整合素β3)可以通過依賴TGF-β途徑的活化來促進這種分化[17]。由此可推測MSCs也可能有直接分化為卵母細胞的潛力。相關(guān)研究也證實了MSCs可作為供體細胞擴增卵母細胞[18]。與之相反，大量研究表明MSCs并不能直接分化為卵母細胞而是定位于卵巢基質(zhì)并分泌各種細胞因子，通過旁分泌途徑而改善卵巢儲備功能，而能否恢復生育力更有待于進一步的研究[19]。故可認為MSCs的旁分泌效應(yīng)是增加卵母細胞作用的關(guān)鍵，而MSCs是否能直接分化為卵母細胞尚不能得到確切的結(jié)論。近期國內(nèi)一項研究將小鼠分為對照組、POF組與MenSCs移植組，觀察其成熟卵子數(shù)目，采用分子生物學方法分析各相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果表明MenSCs可旁分泌胰島素樣生長因子1(IGF-1),通過與其受體結(jié)合并下調(diào)靶器官內(nèi)生長因子受體結(jié)合蛋白10的表達,激活PI3K-AKT-FOXO3a信號通路，使FOXO3a磷酸化水平增高從而促進原始卵泡的發(fā)育[20]。為探討UCMSCs對卵巢早衰家兔治療作用及其內(nèi)在機制，學者將POF家兔按是否使用UCMSCs分為治療組和對照組，比較激素變化及相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果表明UCMSCs能通過上調(diào)CYR61和CTGF的表達從而激活休眠的卵泡，改善卵巢功能[21]。另外還有研究表明AMSCs能通過上調(diào)相關(guān)干細胞功能蛋白來減少卵巢生殖干細胞的消耗，促進其分化為原始卵泡，改善微環(huán)境從而恢復卵巢功能[22]?？傊?，MSCs可通過改善生殖細胞的發(fā)育和減少原始生殖干細胞的消耗恢復卵巢功能，而其具體機制仍有待進一步探討。

4 MSCs與卵巢血管

卵巢復雜血管系統(tǒng)的建立與重塑是卵巢發(fā)育及維持功能的基礎(chǔ)。卵泡和/或黃體可通過卵巢血管獲取營養(yǎng)支持，運輸相關(guān)激素到靶器官[23]。血管系統(tǒng)受損可導致卵巢功能異常，造成一系列相關(guān)疾病。有證據(jù)表明化療藥物可以引起皮質(zhì)纖維化和血管損傷，而這種損傷與POF相關(guān)。有學者通過標記BMSCs特異標志物觀察其在卵巢中分布情況，發(fā)現(xiàn)BMSCs主要分布在受損卵巢的血管中[24]。由此推斷BMSCs可能作用于卵巢血管而發(fā)揮作用。在此基礎(chǔ)上，一項有關(guān)MenSCs的研究表明其可通過分泌VEGF、IGF-1、G-CSF、HGF等相關(guān)細胞因子促進卵巢血管再生，減輕間質(zhì)纖維化，從而改善卵巢功能[25]。微泡(microvesicles，MVs)作為一種攜帶細胞來源的膜和細胞質(zhì)成分的直徑<1 μm的小泡，可以通過表面表達的配體和表面受體將mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細胞，從而影響靶細胞的表型和功能[26-27]。MSCs分泌的MVs可能通過各種方式修復受損組織。一項有關(guān)UCMSC-MVs移植治療POI小鼠的研究表明，UCMSC-MVs攜帶的相關(guān)蛋白可通過激活PI3K/AKT信號途徑誘導血管生成，從而改善卵巢功能[28]。而這項研究發(fā)現(xiàn)MSC-MVs移植可作為一種新的無細胞治療方法，為POI的治療提供一種新的思路?？傊?，MSCs可通過各種方式誘導卵巢血管生成，修復受損的卵巢，從而改善卵巢功能。

5 MSCs與免疫調(diào)節(jié)

免疫異常是造成POF的原因之一。10余年前已有報道MSCs在體外和體內(nèi)對幾乎所有類型的免疫細胞都有調(diào)節(jié)作用[29-31]。眾所周知，MSCs可通過抑制淋巴細胞激活和增殖，抑制促炎細胞因子的分泌，抑制抗原呈遞細胞的功能以及激活調(diào)節(jié)性T(regulatory T cells，Treg)和B(regulatory B cells，Breg)細胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[32]。近年來研究發(fā)現(xiàn)POF存在T細胞亞群的比例失常，主要表現(xiàn)為Treg數(shù)量減少，及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值下降[32-33]。而ADMSCs聯(lián)合雌激素可促進 POI 患者外周血中Treg細胞的分化，從而改善卵巢功能[34]。既往研究表明MSCs可通過可溶性介質(zhì)的刺激、細胞-細胞間相互作用和抗原呈遞細胞的作用來調(diào)節(jié)Treg細胞。相關(guān)機制可能為在炎性環(huán)境下，MSCs分泌TGF-β1，PGE2和IDO等細胞因子，以促進幼稚T細胞向Foxp3+Treg細胞的分化。MSC也可以通過CD54和C11a / CD18直接接觸而與Th17細胞相互作用，在PGE2的幫助下分化的Th17細胞可轉(zhuǎn)化為功能性Foxp3+Treg細胞，MSCs還可通過抗原呈遞細胞增加IL-10的分泌，從而誘導Tr1細胞分化[35]。近期，為研究MSCs對免疫調(diào)節(jié)的機制，有學者在用MSCs治療的POF小鼠中加入PI3K/Akt抑制劑以觀察其對卵巢功能恢復和免疫調(diào)節(jié)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入PI3K/Akt抑制劑后其卵巢功能明顯下降，Th17/Tc17和Th17/Treg細胞比率增加，故可以表明MSCs可通過PI3K/Akt信號途徑參與Th17/Tc17和Th17/Treg細胞的調(diào)節(jié)從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，恢復卵巢功能[4]。綜上所述，MSCs主要通過調(diào)節(jié)Treg細胞來參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)從而改善POF患者的卵巢功能，其分子機制可能與炎性因子對免疫細胞的調(diào)節(jié)以及PI3K/Akt通路的激活相關(guān)，由于其相關(guān)研究較少，具體的分子機制有待進一步研究。

6 MSCs與氧化應(yīng)激反應(yīng)

氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)是由于細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過多，造成氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡的一種現(xiàn)象，它與組織損傷與衰老密切相關(guān)，可能是造成POF的原因之一。既往研究表明MSCs可以通過分泌HGF、IL-6、IL-8、VEGF、BDNF、LIF 等相關(guān)細胞因子及外泌體，激活FOXO、NOQ1/MAPK、PI3K/Akt、Nrf2-ARE等相關(guān)通路，增加抗氧化作用酶的生成，抑制ROS產(chǎn)生，從而起到抗氧化應(yīng)激的作用，由此改善卵巢功能[36]。除此之外，近來一項針對POF模型大鼠的研究表明MSCs移植還可激活SIRT1/PGC1-α/Nrf2通路，起到抗氧化，修復卵巢的作用[37]。大量研究證明，褪黑素能與褪黑素膜受體(MT)結(jié)合起到抗氧化作用并介導細胞保護。為探討MSCs的抗氧化作用是否還與MT相關(guān)，有學者通過對胎肝間充質(zhì)干細胞(fetal liver mesenchymal stem cells，fMSCs)的研究發(fā)現(xiàn)其在mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)MT1、JNK1、PCNA和AMPK，抗氧化作用加強，而敲除MT1基因后發(fā)現(xiàn)JNK1、PCNA、AMPK蛋白表達下降，抗氧化作用受抑，故可認為fMSCs抗氧化作用與MT1相關(guān)，而MT1也可作為用以治療POF的另一靶點[38]。綜上所述，我們不難得出MSCs可能通過自分泌或旁分泌作用分泌各種細胞因子或是產(chǎn)生外泌體或是靶向作用于MT1激活相關(guān)信號通路，抑制ROS的產(chǎn)生，從而恢復“氧化-抗氧化”系統(tǒng)的平衡，修復損傷的卵巢，起到治療POF的作用。

7 MSCs的歸巢與增強MSCs作用的因素

歸巢是指干細胞在多種因素的刺激下遷移到損傷組織并通過各種機制發(fā)揮作用，從而促進受損組織的恢復過程。研究發(fā)現(xiàn)用環(huán)磷酰胺誘導的POF小鼠體內(nèi)TNF-α水平較正常小鼠升高，而這種細胞因子可趨化BMSCs向受損的卵巢遷移，促進MSCs的歸巢[39]，研究證明趨化因子家族及其受體與之密切相關(guān)。其中基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF1)及其受體(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)組成的SDF1/CXCR4軸在MSCs的歸巢作用中起到重要作用。該通路的激活不僅可以促進MSCs的歸巢，還可以抑制其凋亡，同時刺激bFGF和VEGF的分泌，增強MSCs的作用，促進卵巢功能的恢復[40]。由此推測外界添加趨化因子有可能促進MSCs的歸巢，而這種歸巢作用是MSCs作用的基礎(chǔ)。既往研究表明，熱休克預(yù)處理能提高干細胞對缺血再灌注損傷的修復率。熱休克預(yù)處理過的MSCs對藥物性POF具有更強的修復作用，而其機制可能與MAPK通路激活有關(guān)[41]。眾所周知，低氧刺激最開始對細胞活性有抑制作用，甚至會促進細胞的凋亡，而此后又反而會激活細胞活力，促進細胞因子的分泌，增強其遷移能力[19]。由于這種特性，推測低氧預(yù)處理可能會加強MSCs的作用。為驗證這一猜測有學者將低氧預(yù)處理后的UMSCs與正常UMSCs分別移入POI小鼠，觀察卵巢功能，結(jié)果表明無論是否經(jīng)過低氧預(yù)處理，用UMSCs治療的小鼠卵巢功能均有明顯的改善，而低氧預(yù)處理后卵巢功能改善情況更為明顯[42]。miR-21作為一種內(nèi)源性非編碼RNA，可通過調(diào)控靶基因來調(diào)節(jié)包括卵巢顆粒細胞在內(nèi)的各種細胞的分化、增殖和凋亡。為研究過表達miR-21的BMSCs的作用是否能如愿增強，相關(guān)動物實驗構(gòu)建了添加miR-21的BMSCs (miR-21-BMSCs) 同時與正常BMSCs分別作用于POF小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21-BMSCs對POF小鼠的治療效果明顯加強，而這種作用可能與其調(diào)控靶基因PTEN、PDCD4密切相關(guān)[43]。

8 總 結(jié)

MSCs作為一種有多項分化潛能的成體干細胞在POF的治療方面有巨大的潛力。不同來源的MSCs治療POF有著相似的療效，作用機制類似，總體可歸納為MSCs可歸巢于卵巢，不僅可增加卵巢各級卵泡數(shù)，改善內(nèi)分泌功能，還可增加受孕率。研究表明其主要通過作用于卵巢顆粒細胞、原始生殖細胞及卵巢血管等相關(guān)細胞和組織或是發(fā)揮其免疫作用和抗氧化應(yīng)激作用而刺激卵巢功能的恢復，具體分子學機制還有待于進一步的探討。熱休克及低氧預(yù)處理或是增加miR-21的表達能夠加強MSCs的作用，這種預(yù)處理或可為MSCs相關(guān)研究提供一定的借鑒作用。深入了解MSCs治療POF的機制，評估其在人體中的安全性和有效性可為進一步臨床研究打下基礎(chǔ)?？傊?，MSCs不僅有望恢復POF患者的卵巢功能，更是為不孕患者帶來了曙光，具有廣闊的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。