CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展

葉洲杰 王心睿

（1.福建省兒童醫(yī)院，福州 350011；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬福建省婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心，福州 350001；3.福建省婦幼保健院福建省婦兒重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗室，福州 350001；4.國家衛(wèi)健委非人靈長類生育調(diào)節(jié)技術(shù)評價重點(diǎn)實(shí)驗室，福州 350013）

探究基因在信號通路中的功能與在人類疾病研究中的作用，仍然是基礎(chǔ)科學(xué)研究的重要內(nèi)容?；蚓庉嫾夹g(shù)作為后基因組學(xué)時代的重要研究工具，是研究基因功能的重要手段。人類從未停止在基因編輯技術(shù)上的探尋和革新，其研究歷程從鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）到規(guī)律性成簇間隔的短回文重復(fù)序列簇技術(shù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）有了飛速的發(fā)展［1］。CRISPR/Cas技術(shù)具有高效、便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)，能夠在細(xì)胞或動物水平實(shí)現(xiàn)高效率的基因敲除，而受到廣泛的研究運(yùn)用。

CRISPR/Cas系統(tǒng)是以細(xì)菌和古細(xì)菌的長期演化過程中形成的適應(yīng)性天然防御機(jī)制為基礎(chǔ)發(fā)展成的一項新基因編輯技術(shù)［2］，Ⅱ型CRISPR/cas系統(tǒng)在發(fā)揮基因編輯功能時只需要Cas9一種核酸酶參與作用，避免了其它類型CRISPR需要多蛋白相互作用的過程［3-4］。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)憑借其簡單方便、操作性強(qiáng)等優(yōu)勢，2013年被Science雜志列入十大科技研究進(jìn)展之一，同時Nature雜志子刊方法學(xué)雜志將其列入2013年年度研究方法。運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚、小鼠、恒河猴、果蠅等動物的受精卵或胚胎進(jìn)行基因敲除，構(gòu)建基因敲除模型，在生長機(jī)制調(diào)控、腫瘤免疫治療、藥物靶點(diǎn)研究分析、耐藥機(jī)制研究等研究中起到重要作用。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介紹

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要兩部分組成（圖1）：一部分由crRNA（CRISPR-derived RNA）含有20 nt序列能夠特異性結(jié)合不同靶標(biāo)基因。crRNA與tracrRNA（trans-activating RNA）形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物作為Cas9蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，招募Cas9蛋白到crRNA結(jié)合的基因序列處對目的基因進(jìn)行切割［6-7］；另一部分為具有Ruvc1和HNH核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白［8］，蛋白兩端攜帶了核定位信號NLS，確保Cas9蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞核完成對目的基因序列的特異性切割［9］。為了保證Cas9蛋白的有效切割活性，sgRNA靶標(biāo)目的基因序列的3'端要具有前間區(qū)序列鄰近基序（PAM，-NGG-）位點(diǎn)的存在［10］。

細(xì)胞對于損傷的DNA序列能夠通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源介導(dǎo)雙鏈DNA修復(fù)（Homology directed repair，HDR）對斷裂的DNA鏈進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)對DNA序列的特異性突變［11］。對于sgRNA有可能存在基因脫靶與非靶標(biāo)基因配對而引入新的突變，導(dǎo)致實(shí)驗現(xiàn)象不準(zhǔn)確出現(xiàn)誤差等一系列問題，一直存在爭議。2019年，宿兵團(tuán)隊［12］使用與人類進(jìn)化關(guān)系最為接近的獼猴，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建MCPH1基因缺失小頭癥獼猴模型，通過對多只MCPH1基因缺失獼猴與其野生型父母本獼猴進(jìn)行二代測序分析，比對發(fā)現(xiàn)在MCPH1缺失獼猴基因組中并未出現(xiàn)大量新發(fā)突變，擴(kuò)增子測序結(jié)果顯示在sgRNA對應(yīng)基因切割區(qū)域也并未發(fā)現(xiàn)長片段的基因結(jié)構(gòu)變異。研究結(jié)果表明在非人靈長類獼猴基因組中，CRISPR/Cas9不會導(dǎo)致較高的基因突變，具有一定的安全性。

2 CRISPR/Cas9生命科學(xué)研究應(yīng)用

2011年，Bhaya等［13］將外源自發(fā)突變抗噬菌體感染嗜熱鏈球菌的CRISPR系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌中，大腸桿菌獲得了抗噬菌體感染能力。2013年，張峰團(tuán)隊［14］將Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對于哺乳動物的基因編輯。這些研究結(jié)果證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在不同物種間發(fā)揮相同的功能。至2013年以來，人們運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在基礎(chǔ)科學(xué)中的研究成果澎涌而出。2017年，李曉江課題組［15］運(yùn)用腺病毒侵染運(yùn)送的方式敲除亨廷頓模型小鼠腦細(xì)胞中的mHTT基因，發(fā)現(xiàn)缺失mHTT基因表達(dá)后能夠恢復(fù)亨廷頓小鼠的運(yùn)動能力。2019年，馮國平課題組［16］利用CRISPR基因編輯技術(shù)對恒河猴的SHANK3基因進(jìn)行敲除，探究SHANK3在自閉癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴在缺失SHANK3后睡眠質(zhì)量降低且重復(fù)性動作增多。非人靈長類自閉癥模型對于了解人類腦神經(jīng)環(huán)路異常以及自閉癥相關(guān)疾病具有重要的科學(xué)意義。

運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅能夠運(yùn)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究中，其在臨床研究中也具有重要作用。CAR-T作為白血病治療的重要手段，對于血液癌癥與淋巴細(xì)胞癌具有明顯的治療效果，然而目前在T細(xì)胞中插入嵌合抗體片段主要還是通過慢病毒或轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入T細(xì)胞基因組中，隨機(jī)插入造成T細(xì)胞基因功能的破壞以及出現(xiàn)的風(fēng)險是不可而預(yù)的［17］。2018年，F(xiàn)raietta等［18］在T細(xì)胞的TET2基因中利用CRISPR/Cas9和同源重組的方式插入CD-19 CAR，電轉(zhuǎn)染方式在外源載體導(dǎo)入T細(xì)胞中，定點(diǎn)敲入外源表達(dá)閱讀框，從而實(shí)現(xiàn)了在T細(xì)胞中定點(diǎn)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞。2020年，李大力課題組［19］運(yùn)用CRISPR單堿基突變技術(shù)，成功編輯HBG1/2啟動子上的BCL11A結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)β地中海貧血患者中的γ珠蛋白的表達(dá)，明顯改善了患者體內(nèi)紅細(xì)胞的成熟程度，運(yùn)用基因編輯技術(shù)有望成為治愈β地中海貧血的治療手段。

現(xiàn)今對于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究以及運(yùn)用已經(jīng)逐漸成熟，該技術(shù)已經(jīng)成功被運(yùn)用到小鼠、獼猴、擬南芥、線蟲、果蠅等動植物基因研究中［20］。CRISPR技術(shù)除了用于基因功能研究之外，CRISPR系統(tǒng)延伸應(yīng)用對于在后基因組學(xué)時代高通量篩選人類疾病調(diào)控基因、腫瘤耐藥機(jī)制研究、遺傳性疾病與病原微生物感染疾病診斷同樣具有重要研究意義，有效推動了人類臨床醫(yī)學(xué)研究發(fā)展。

3 CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用擴(kuò)展

3.1 CRISPR診斷技術(shù)

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的運(yùn)用風(fēng)靡全球時，張峰、Doudna等多位研究者對除Cas9蛋白以外的CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）研究逐漸深入，研究發(fā)現(xiàn)自然界中存在著多種功能結(jié)構(gòu)不同的Cas蛋白［22-23］。通過Cas蛋白的切割活性，利用CRISPR系統(tǒng)作為體外分子診斷，將CRISPR技術(shù)應(yīng)有推向了一個新高度［21］。CRISPR診斷技術(shù)能夠在體外方便快捷地識別診斷病原體基因序列，在對靶標(biāo)序列切割時釋放信號達(dá)到對疾病的快速診斷，其在新生兒產(chǎn)前篩查、遺傳病診斷、病毒感染檢測等方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢，與常規(guī)RT-PCR的基因檢測鑒定技術(shù)相比具有靈敏度強(qiáng)，方便，快速等特點(diǎn)，能適用于偏遠(yuǎn)山區(qū)醫(yī)療設(shè)施條件差的地區(qū)，甚至能夠做到即時檢測。

2015年，張峰等研究發(fā)現(xiàn)另一II型CRISPR系統(tǒng)的核酸內(nèi)切酶Cas12a蛋白，其同樣具有在sgRNA引導(dǎo)下對雙鏈DNA進(jìn)行特異性切割的活性［22］。隨后Doundna等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cas12a蛋白對雙鏈DNA進(jìn)行切割后，它能對周圍的單鏈DNA進(jìn)行極高活性的隨機(jī)切割［23］。利用這個特性，Doundna團(tuán)隊研發(fā)了DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）診斷系統(tǒng)，在DETECTR系統(tǒng)中包含了CRISPR-Cas12a、特異性針對靶標(biāo)sg-RNA、熒光報告分子（圖2）。Doundna運(yùn)用RPA（Recom-binase polymerase amplification）等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，在37℃ RPA能對靶標(biāo)基因?qū)嵭锌焖贁U(kuò)增。Cas12a對靶標(biāo)基因進(jìn)行切割后能夠?qū)χ車鷨捂湡晒鈭蟾娣肿舆M(jìn)行切割，切割暴露后的熒光基團(tuán)信號能夠被信號采集器收集，通過評估熒光強(qiáng)度，判斷樣本中是否存在sgRNA特異性結(jié)合的靶標(biāo)基因序列。Cas12a被開發(fā)成高靈敏度的DNA分子檢測工具，Doundna博士運(yùn)用該系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測出含人乳頭瘤病毒（HPV）患者樣本中的HPV16和HPV18這兩個高風(fēng)險類型［24］。CRISPR-Cas12a對于腫瘤和傳染性疾病等的DNA分子檢測，這也暗示了運(yùn)用CRISPR系統(tǒng)作為臨床診斷技術(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力。

CRISPR診斷技術(shù)同樣能夠適用于RNA分子診斷，2016年，張峰等發(fā)現(xiàn)Cas13a蛋白在切割靶標(biāo)RNA序列后仍能保持切割活性對周圍RNA進(jìn)行切割［26］，人們將這一現(xiàn)象稱為“collateral cleavage”。根據(jù)這一特性Doundna將Cas13a蛋白運(yùn)用于RNA診斷中［27］，將Cas13a蛋白的“collateral cleavage”特性運(yùn)用于RNA檢測（圖3）。然而最初Cas13a用于RNA檢測技術(shù)的靈敏度有待提高，這使CRISPR RNA診斷技術(shù)的發(fā)展受到了局限。2017年，張峰等對CRISPR/Cas13a診斷平臺進(jìn)行了優(yōu)化，SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）系統(tǒng)將診斷靈敏度提升百萬倍，能夠檢測出每微升體積中只含1個拷貝的寨卡病毒或登革熱病毒［28］。2018年，Science雜志中連發(fā)4篇關(guān)于CRISPR/Cas13a 技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，張峰等開發(fā)的HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）技術(shù)在常溫下結(jié)合SHERLOCK系統(tǒng)能夠在2 h內(nèi)快速完成對患者體內(nèi)登革熱病毒檢測［29-30］。CRISPR診斷技術(shù)的簡便快捷和高靈敏度等特點(diǎn)與傳統(tǒng)臨床醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)相比不需要復(fù)雜的檢測儀器設(shè)備，張峰等將檢測信號以檢測試紙的方式展現(xiàn)在人們面前［30］，在高靈敏度檢出效率的的同時，避免了攜帶儀器設(shè)備不便以及高成本檢測等問題，其作為臨床轉(zhuǎn)化研究應(yīng)用對于人類健康安全具有重要作用。

圖2 CRISPR/Cas12a體外診斷圖示［23］

2019年中國爆發(fā)新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）造成全國數(shù)萬人感染，由于能夠在人群中接觸傳播，造成了高傳染性與高致死性，SARS-CoV-2的死亡率為2%［31］，已經(jīng)對生命安全與正常工作活動產(chǎn)生嚴(yán)重危害。SARS-CoV-2病毒具有14-20 d不等的潛伏期，常規(guī)的real-time PCR和膠體金病毒檢測法由于靈敏度不高且對病毒檢出拷貝數(shù)有要求，導(dǎo)致不能夠及時檢測病毒的存在，使得病毒攜帶者能夠在人群中廣泛傳播。2020年2月，張峰等向全球公布了使用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)檢測新型冠狀病毒的詳細(xì)操作流程文檔，SHERLOCK技術(shù)檢測新冠病毒高靈敏性，可以檢測出每微升僅10-100個拷貝的病毒。由于該方法操作簡單，只需純化的核酸分子樣本，1 h即可完成檢測，減少了常規(guī)核酸提取等實(shí)驗操作過程，能夠快速方便地準(zhǔn)確檢測患者體內(nèi)是否存在新型冠狀病毒。

圖3 CRISPR/Cas13a分子診斷示意圖［25］

張峰團(tuán)隊利用Cas13核酸酶的酶切活性研發(fā)出高靈敏度的人類體內(nèi)RNA病毒，細(xì)菌或其他靶標(biāo)存在的RNA分子診斷技術(shù)后，對核酸分子診斷技術(shù)的發(fā)展具有推進(jìn)性的作用。2019年。張峰等將Cas13蛋白的分子診斷能力與抗病毒活性整合在一起，研發(fā) 出CARVER（Cas13-Assisted Restriction of Viral Expression and Readout，Cas13）系統(tǒng)［32］，該系統(tǒng)在識別診斷靶標(biāo)RNA的同時能夠治療病毒的感染，研究者通過確定數(shù)百種可能潛在感染人類的ssRNA病毒物種中的數(shù)千個潛在Cas13 crRNA靶位點(diǎn)，首先將Cas13蛋白表達(dá)載體與工程化的crRNA導(dǎo)入細(xì)胞中，24 h后將淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）、甲型流感病毒（IAV）和水泡性口炎病毒（VSV）3種不同RNA病毒分別侵染宿主細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)在感染24 h后，宿主細(xì)胞中的病毒RNA水平顯著降低40多倍，而在IAV病毒侵染宿主細(xì)胞8h后，檢測發(fā)現(xiàn)IAV病毒的侵染能力降低了300多倍。運(yùn)用CARVER系統(tǒng)在檢出靶標(biāo)病毒存在的同時能夠有效清除人體內(nèi)的RNA病毒，其對于針對已知或新發(fā)現(xiàn)的人類病原體感染時，作為快速診斷和抗病毒藥物研發(fā)中具有巨大的潛力。2020年，面對突發(fā)性新型冠狀病毒感染肺炎爆發(fā)，哈佛醫(yī)學(xué)院Nguyen等［33］以腺相關(guān)病毒為載體將CRISPR/Cas13d系統(tǒng)與多個靶向SARS-CoV-2病毒多肽編碼區(qū)的guide RNA輸入新冠肺炎患者體內(nèi)。Cas13d的核酸酶活性切割SARS-CoV-2病毒RNA序列，從而避免了病毒的復(fù)制增殖導(dǎo)致對人體的傷害，運(yùn)用“病毒殺傷病毒”的研究治療方法，避免了由于病毒容易突變而導(dǎo)致對抗病毒藥物耐藥性問題的出現(xiàn)，對于高效、方便、高靈活性的快速治療預(yù)防RNA病毒，以及對于已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的突變RNA病毒治療提供一種新的臨床治療手段。然而在進(jìn)入臨床研究之前需在非人靈長類等動物模型中對其診斷SARS-CoV-2或其它RNA病毒的安全性與高效性評估。

運(yùn)用CRISPR體外診斷檢測平臺能夠?qū)π滦凸跔畈《?、寨卡病毒、登革熱病毒等烈性病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確的判定，及時有效對患者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷治療隔離，減少病毒傳播。CRISPR在醫(yī)療設(shè)施條件薄弱地區(qū)能夠起到強(qiáng)大檢測作用的同時，還能夠針對病毒對治療藥物產(chǎn)生耐藥性，作為一種新的病毒臨床治療手段；不同亞型的病毒檢測區(qū)分；臨床表型相似的RNA病毒區(qū)分；抗生素耐藥性基因檢測等方面具有眾多應(yīng)用。CRISPR診斷技術(shù)同時推動了臨床即時檢驗技術(shù)（Point-of-care testing，POCT）的發(fā)展，在不需要專業(yè)臨床檢驗醫(yī)生存在的情況下，通過檢驗試紙等就能快速準(zhǔn)確對傳染性疾病進(jìn)行檢測，對于對癥及時救治提升患者生存率，減緩疾病的傳播具有重大意義。

3.2 CRISPR基因敲除文庫

人類及模式生物基因組計劃研究的初步完成，人們對于基因功能有了一定的認(rèn)知，但對于基因在人類生理功能調(diào)控、基因參與的信號通路研究、基因與對于腫瘤治療藥物和抗病毒藥物等的耐藥性機(jī)制以及更多問題仍有待科學(xué)家們的探索。如何利用現(xiàn)有的科學(xué)實(shí)驗手段以及對基因功能的認(rèn)知，解決疾病的發(fā)病過程和發(fā)生機(jī)制、通過尋找與人類疾病相關(guān)的功能性基因，為人類臨床疾病治療研究新的靶點(diǎn)與研究新的治療藥物具有重要意義。

高通量基因篩選技術(shù)的出現(xiàn)在全基因組范圍或部分基因組范圍內(nèi)通過干擾基因表達(dá)篩選候選基因，成為功能性基因篩選的重要手段。CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展使得在多基因范圍甚至全基因組規(guī)模上構(gòu)建基因敲除載體文庫成為了可能。使用CRISPR基因敲除文庫構(gòu)建細(xì)胞敲除文庫在哺乳動物全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行基因敲除并篩選候選基因開創(chuàng)了基因組研究的新時代［34］。前期使用cDNA文庫基因外源過表達(dá)系統(tǒng)篩選候選基因，但是由于細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組比較復(fù)雜存在不同剪切體等情況，使得cDNA文庫不能覆蓋完整基因組［35］。RNAi干擾文庫也曾被用于基因功能缺失篩選［36］，siRNA通過降解同源mRNA序列而降低基因表達(dá)，但是siRNA并不能完全抑制基因的表達(dá)［37］，使得實(shí)驗觀測表型不明顯且存較高脫靶率［38］。CRISPR/Cas9敲除文庫由于特異性強(qiáng)，覆蓋性廣等特點(diǎn)能夠很好地彌補(bǔ)上述高通量篩選系統(tǒng)的不足而廣受青睞。2014，張峰等靶向人類基因組中18 080個基因構(gòu)建人類全基因組CRISPR敲除慢病毒文庫，每個慢病毒載體中攜帶了靶定不同基因的sgRNA，利用該系統(tǒng)在黑色素瘤模型中篩選維羅非尼耐藥性基因，從中研究發(fā)現(xiàn)了NF2、CUL3、TADA1等基因參與了維羅非尼耐藥機(jī)制調(diào)控［39］。對于在腫瘤治療過程中出現(xiàn)的耐藥性問題，一直成為急需解決的臨床治療問題。利用CRISPR全基因組敲除文庫進(jìn)行高通量耐藥基因篩選，為腫瘤臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)和研究手段。

病毒感染造成的人類疾病往往由于其與宿主作用機(jī)制尚未明確，而造成巨大危害，如2019年底爆發(fā)的新型冠狀病毒造成人類肺炎感染。運(yùn)用CRISPR/Cas9基因敲除文庫篩選病毒受體或宿主病毒依賴基因，有助于開發(fā)新的傳染性疾病預(yù)防和治療藥物。2018年，Han等［40］在人肺上皮細(xì)胞中利用全基因組敲除文庫構(gòu)建了一個含1.9萬個不同基因打靶的肺上皮細(xì)胞敲除文庫，禽流感病毒H5N1侵染文庫細(xì)胞后，高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，SLC35A1基因作為H5N1病毒細(xì)胞受體參與病毒結(jié)合，而CIC基因能夠調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫調(diào)控應(yīng)答，缺失CIC時肺上皮細(xì)胞能夠表現(xiàn)出良好抗病毒效果。

根據(jù)信號通路以及基因作用靶點(diǎn)合理設(shè)計敲除文庫大小，結(jié)合正向篩選系統(tǒng)或負(fù)向篩選系統(tǒng)，CRISPR基因敲除文庫能夠有效的用于藥物作用基因靶點(diǎn)篩選、癌癥驅(qū)動基因篩選、抗病毒感染基因與長鏈非編碼RNA等研究中。

3.3 CRISPR干擾

人們對Cas9蛋白結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白具有識別sgRNA指導(dǎo)與靶標(biāo)基因結(jié)合結(jié)構(gòu)域外還存在兩個核酸酶切結(jié)構(gòu)域，能夠在PAM位點(diǎn)前3個堿基處對雙鏈DNA進(jìn)行切割，人們通過突變的方式“鈍化”Cas9蛋白的切割活性，保留在sgRNA引導(dǎo)下以相同精確度與靶基因結(jié)合能力，形成dCas9蛋白［41］。dCas9蛋白通過與轉(zhuǎn)錄激活或抑制因子等效應(yīng)器結(jié)合，在啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件或CDS區(qū)等在不對DNA進(jìn)行精準(zhǔn)切割下對基因表達(dá)起到調(diào)控作用，這種調(diào)控作用既可以增強(qiáng)基因的表達(dá)也可以抑制基因表達(dá)。

2013年，F(xiàn)ujita等［42］將化膿性鏈球菌Cas9蛋白核酸酶結(jié)構(gòu)域引入RuvC結(jié)構(gòu)域D10A和HNH結(jié)構(gòu)域H840A突變，突變后的Cas9蛋白稱為dCas9蛋白。dCas9失去對雙鏈DNA核酸酶切割活性，而保留了在guide RNA引導(dǎo)下與目的基因特異性結(jié)合能力。dCas9蛋白與Kox1蛋白轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域KARB形成融合蛋白，KARB通過招募多種組蛋白修飾因子通過形成異染色質(zhì)從而抑制了基因表達(dá)［43］。dCas9-KARB系統(tǒng)在不破壞細(xì)胞基因組前提下，有效的抑制了基因的表達(dá)水平。2016年，Liu等［44］對人類6類轉(zhuǎn)化細(xì)胞和一種誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中16 401個長鏈非編碼LncRNA作用位點(diǎn)篩選，利用CRISPR干擾技術(shù)抑制了這些非編碼轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，探究其作用位點(diǎn)參與細(xì)胞生長的調(diào)控。研究篩選發(fā)現(xiàn)了499個位點(diǎn)對于細(xì)胞穩(wěn)定生長是必須的。CRISPRi技術(shù)適用于長鏈非編碼RNA的研究中，結(jié)合單細(xì)胞測序技術(shù)能夠很好的用于細(xì)胞生長分化通路研究。

CRISPR/dCas9系統(tǒng)除了dCas9蛋白與KARB等轉(zhuǎn)錄抑制因子形成融合蛋白，阻滯基因轉(zhuǎn)錄從而敲降基因表達(dá)水平外，還可以運(yùn)用于表觀遺傳修飾參與基因表達(dá)調(diào)控的研究［45］，如組蛋白乙?；痙Cas9-P300修飾表觀遺傳激活系統(tǒng)；組蛋白去甲基化dCas9 LSD1表觀遺傳抑制系統(tǒng)；DNA甲基化dCas9-DNMT3A 修飾系統(tǒng)等研究中。利用sgRNA識別特異性的靶標(biāo)基因，dCas9蛋白攜帶基因修飾因子準(zhǔn)確定位靶基因，探究基因調(diào)控過程。

3.4 CRISPR/dCas9激活系統(tǒng)

經(jīng)過改良的跨表觀遺傳調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)激活基因表達(dá)，對于恢復(fù)沉默基因表達(dá)、彌補(bǔ)基因缺陷、改變細(xì)胞命運(yùn)等有重大研究意義［46］。許多疾病的發(fā)生并非由于基因突變造成，而是由于表觀遺傳學(xué)修飾過度甲基化或乙?；茸璧K了基因表達(dá)［47］。研究表明表觀遺傳學(xué)與疾病發(fā)生具有密切的關(guān)系，在白血病與淋巴癌中過度甲基化導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤能力加強(qiáng)，在慢性淋巴白血病中也顯示出更高水平的甲基化異常［48］。CRISPR/dCas9系統(tǒng)揭示了一個基因跨表觀遺傳修飾表達(dá)技術(shù)平臺，酶切結(jié)構(gòu)域失活的dCas9蛋白不具備核酸酶活性，在sgRNA牽引下dCas9蛋白特異性地與目的基因結(jié)合，dCas9蛋白能夠招募內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動基因的翻譯表達(dá)。

2013年，Maeder等［49］對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改造，研究者對Cas9蛋白的核酸酶活性進(jìn)行破壞，而保留了在sgRNA引導(dǎo)下與靶基因特異性活性，稱為dCas9。研究者將dCas9與轉(zhuǎn)錄因子VP64構(gòu)建融合蛋白，VP64是一種RNA結(jié)合蛋白，可以與轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而提高基因的表達(dá)水平［50］。在sgRNA的指導(dǎo)下dCas9-VP64融合蛋白特異性地結(jié)合在神經(jīng)營養(yǎng)因子NTF3的啟動子序列上，特異性地激活NTF3基因的表達(dá)［51］。2017年，Liao等［52］在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中引入轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物MS2-P65-HSF1（MPH）［53］，并縮短了sgRNA的長度成為14 nt RNA的dgRNA，guide RNA長度的縮短能夠避免Cas9蛋白切割DNA序列。如圖4所示，研究者在Cas9模型小鼠中通過靶向激活基因成功修復(fù)急性腎損傷、I型糖尿病等疾病表型。運(yùn)用CRISPR/dCas9激活系統(tǒng)，能夠提升細(xì)胞靶標(biāo)基因表達(dá)，從而達(dá)到劑量補(bǔ)償效應(yīng)。在人體基因中往往很多單基因拷貝的發(fā)生就能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，2018年，Matharu等［54］構(gòu)建SIM1單拷貝突變模型小鼠，小鼠缺失一個拷貝的SIM1基因表達(dá)后，能夠?qū)е路逝职Y的發(fā)生。研究者在小鼠4周齡時通過AAV腺相關(guān)病毒將dCas9-VP64和靶標(biāo)SIM1基因啟動子區(qū)域的sgRNA運(yùn)送進(jìn)小鼠腦部。研究發(fā)現(xiàn)接受CRISPRa（CRISPR activation）治療的老鼠SIM1基因表達(dá)水平能夠恢復(fù)至野生型小鼠水平，而且體重比對照小鼠減輕40%左右，身體也更加健康。運(yùn)用CRISPRa系統(tǒng)恢復(fù)基因表達(dá)劑量從而治療基因單拷貝變異疾病提供了一個新的治療思路。

圖4 改進(jìn)的CRISPR/Cas9激活系統(tǒng)圖示

某些疾病的發(fā)生或生理功能紊亂是由于基因沉默或表觀遺傳學(xué)修飾導(dǎo)致基因表達(dá)劑量不足造成。CRISPR/dCas9激活文庫在恢復(fù)沉默基因表達(dá)，對疾病、病毒感染等研究中顯示出了巨大潛力。2015年，張峰等運(yùn)用CRISPR/dCas9系統(tǒng)針對人體2萬多個基因設(shè)計70 290個sgRNA，構(gòu)成人全基因組CRISPR/dCas9激活文庫［55］。篩選促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞抵抗BRAF抑制劑PLX-4720耐藥激活基因，研究者將CRISPR激活系統(tǒng)導(dǎo)入大量的黑色素瘤細(xì)胞中，在激活細(xì)胞文庫中進(jìn)行PLX-4720耐藥激活基因篩選。實(shí)驗得到候選基因BCAR3與EGFR作為ERK信號通路下游和上游調(diào)控點(diǎn)參與耐藥機(jī)制［56-67］。2017年，Heaton 等［58］運(yùn)用CRISPR/dCas9激活系統(tǒng)構(gòu)建靶向人全基因組23 430個基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游200 bp左右的sgRNA文庫［59］，將融合蛋白dCas9-VP64與轉(zhuǎn)錄因子MS2-p65-HSF1導(dǎo)入肺腺癌上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中，構(gòu)建A549全基因組激活細(xì)胞文庫。使用甲型流感病毒（IVA）篩選過表達(dá)基因后能夠抵御IVA病毒的侵染，高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中過表達(dá)B4GALNT2基因后能夠顯著抑制IVA病毒的侵染能力，其作為一個新型藥物治療靶點(diǎn)對于抵御甲型病毒流感具有重要意義。

4 結(jié)語

CRISPR基因編輯系統(tǒng)在后基因組時代對于基因功能研究、腫瘤耐藥基因篩選，沉默基因夸表觀遺傳調(diào)控，干擾基因表達(dá)以及病原微生物感染鑒定等用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究有著巨大的研究潛力。CRISPR基因敲除文庫，CRISPR激活系統(tǒng)以及CRISPR干擾技術(shù)在藥物作用靶點(diǎn)，腫瘤驅(qū)動基因研究，長鏈非編碼RNA等研究中具有明顯的優(yōu)勢［60］。以CRISPR系統(tǒng)研發(fā)的基因診斷技術(shù)減少儀器設(shè)備投入的同時，高效快速的能夠檢測出樣本中的目的基因，能夠在病人身邊隨時進(jìn)行診斷檢測。CRISPR系統(tǒng)憑借其方便快捷的特點(diǎn)，被科學(xué)研究者們廣泛運(yùn)用。然而科研工作者在醫(yī)學(xué)研究中必須謹(jǐn)慎使用CRISPR系統(tǒng)，避免“基因編輯嬰兒事件”再次發(fā)生。人們要謹(jǐn)慎使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行人體研究，合理運(yùn)用CRISPR技術(shù)于臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究時，應(yīng)遵循以下幾點(diǎn)原則：必須有支持臨床應(yīng)用的證據(jù)基礎(chǔ)；通過倫理審查持有倫理辯護(hù)；實(shí)驗研究須透明公開等。在生命科學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)等研究中合理運(yùn)用CRISPR系統(tǒng)，對于人類科學(xué)研究事業(yè)發(fā)展具有重要的推進(jìn)作用。