李晶 郭會(huì)琴 于慧 田凌溪 顏流水 劉小明 林立鈳 汪嘉琳

摘?要?全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）作為環(huán)境中最典型的全氟化合物之一，具有持久性、毒性及在生物體內(nèi)積累等效應(yīng)。發(fā)展快速、靈敏檢測(cè)環(huán)境介質(zhì)中PFOS的分析方法具有重要意義。本研究以PFOS為模板分子，N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺為功能單體，設(shè)計(jì)合成了具有介孔結(jié)構(gòu)的表面分子印跡熒光探針NH2-UCNPs@MIPs。PFOS可通過(guò)F-F與靜電相互作用與NH2-UCNPs@MIPs結(jié)合，導(dǎo)致其熒光猝滅，基于此建立了水溶液中PFOS（0.01～15 nmol/L濃度范圍內(nèi)）的高效識(shí)別和高靈敏檢測(cè)技術(shù)，并實(shí)現(xiàn)了在酸性和中性條件下，對(duì)環(huán)境水樣和人血清基質(zhì)樣品中痕量PFOS的檢測(cè)。本研究為復(fù)雜基質(zhì)中PFOS的快速檢測(cè)提供了參考。

關(guān)鍵詞?上轉(zhuǎn)換熒光; 全氟辛烷磺酸; 表面分子印跡; 氟-氟相互作用; 血清

1?引 言

全氟辛烷磺酸 （Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是由疏水疏脂的全氟烷基鏈和極性的磺酸基組成，是一種新型的持久性有機(jī)污染物[1]。PFOS的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使其對(duì)生物和化學(xué)降解具有出色的抵抗能力[2]，一旦排放到環(huán)境中，很難被降解。研究表明，即使微量的PFOS也可能對(duì)人體肝臟、腎臟造成嚴(yán)重的功能損害，對(duì)脂肪酸代謝、生殖系統(tǒng)、激素分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[3，4]。由于PFOS在環(huán)境中存在的廣泛性以及對(duì)生物體的危害，2009年P(guān)FOS被列入《斯德哥爾摩公約》，限制其在全球的生產(chǎn)和使用。2016年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）設(shè)定了飲用水中PFOS終身暴露的健康咨詢水平（Health advisory level，HAL）為70 ng/L[5]。 而我國(guó)僅規(guī)定飲用水中氟化物含量不得超過(guò)1.0 mg/L，尚未制定對(duì)單體PFOS的污染控制濃度限制[6]。 然而，在全世界不同地區(qū)的地表水環(huán)境以及生物樣品中均有PFOS檢出[1]，因此，開(kāi)發(fā)PFOS的檢測(cè)分析方法對(duì)于監(jiān)控水質(zhì)安全及風(fēng)險(xiǎn)暴露途徑具有重要意義。

目前，PFOS常用的檢測(cè)技術(shù)為色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7～10]，但其存在儀器操作復(fù)雜、儀器使用和維護(hù)成本較高， 以及對(duì)操作人員要求較高等問(wèn)題。研究者不斷探索簡(jiǎn)便快速的檢測(cè)方法，其中， 熒光法由于具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前，熒光法檢測(cè)PFOS使用的發(fā)光材料主要為有機(jī)染料[11]和碳點(diǎn)[12]等。稀土上轉(zhuǎn)換材料具有毒性低、化學(xué)穩(wěn)定性高、光穩(wěn)定性好、吸收和發(fā)射帶窄、壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[13，14]，基于其構(gòu)建的熒光探針已引起廣泛關(guān)注。本研究組曾通過(guò)在NaYF4∶Yb，Er納米材料表面簡(jiǎn)單包覆含氟硅烷化試劑，并基于材料表面與PFOS之間的FF相互作用，構(gòu)建了對(duì)PFOS具有較好響應(yīng)的熒光探針，但所構(gòu)建探針仍存在對(duì)PFOS檢測(cè)靈敏度和選擇性不高等問(wèn)題[15]。

分子印跡技術(shù)（Molecularly imprinting technology，MIT）是一種基于“酶-底物”及“抗體-抗原”相互作用原理的制備技術(shù)。將分子印跡技術(shù)的良好選擇性與熒光納米材料的優(yōu)異發(fā)光特性結(jié)合，可構(gòu)建高效識(shí)別和高靈敏檢測(cè)目標(biāo)物的分子印跡熒光探針。目前，所構(gòu)建的針對(duì)PFOS的熒光探針多基于材料表面功能單體與PFOS之間的靜電作用，多在較強(qiáng)酸性條件下使用[16，17]。研究表明，將氟化烷基硅烷在基質(zhì)材料上接枝，材料可通過(guò)FF相互作用對(duì)全氟化合物吸附結(jié)合，并可有效應(yīng)用于樣品前處理，吸附材料在中性條件下表現(xiàn)出與全氟化合物目標(biāo)物較好的結(jié)合效果[18～20]。本研究組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，基于FF相互作用所構(gòu)建的PFOS檢測(cè)探針在弱酸性到堿性條件下也表現(xiàn)出較好的熒光響應(yīng)靈敏度[15]。

經(jīng)二氧化硅包覆后的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料不僅能夠良好地分散在水溶液中， 同時(shí)在二氧化硅表面可方便地進(jìn)行功能化基團(tuán)修飾，有利于進(jìn)一步的應(yīng)用[21，22]。本研究采用氨基修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子（NH2-UCNPs）作為核心支撐材料和熒光信號(hào)源，N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）為功能單體，PFOS為模板分子，正硅酸乙酯（TEOS）為交聯(lián)劑，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為致孔劑，結(jié)合表面分子印跡技術(shù)制備了含有介孔SiO2薄層的NH2-UCNPs@MIPs熒光探針，并對(duì)此探針檢測(cè)PFOS的響應(yīng)時(shí)間、靈敏度、穩(wěn)定性和選擇性進(jìn)行了系統(tǒng)考察。將PFOS加入檢測(cè)體系時(shí)，基于NH2-UCNPs@MIPs與PFOS之間的FF作用與靜電作用導(dǎo)致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)PFOS進(jìn)行定量檢測(cè)，基于此建立了一種高選擇性， 高靈敏， 并可在酸性和中性條件下檢測(cè)多種基質(zhì)中PFOS的熒光分析方法。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

F-7000熒光分光光度計(jì) （日本日立公司）; 高穩(wěn)定性紅外激光器（長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司）; JSM-6700F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡SEM、SM-2010透射電子顯微鏡TEM （日本電子公司）; Nicolet is 5型傅里葉變換紅外光譜儀 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; Nove 2000e比表面分析儀（美國(guó)Quantachrome公司）; 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）; 數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

YCl3·6H2O（99.99%）、YbCl3·6H2O（99.99%）、ErCl3·6H2O（99.99%）、BSTFA（98%）購(gòu)自麥克林試劑公司; N-（β-氨乙基-γ-氨丙基）甲基二甲氧基硅烷（KH-602，≥98%）、全氟辛烷磺酸鹽（98%）購(gòu)自阿拉丁試劑公司; 檸檬酸鈉購(gòu)自上海試四赫維化工有限公司; CTAB和TEOS購(gòu)自西隴化工股份有限公司。所用試劑均為分析純，無(wú)需進(jìn)一步純化。

2.2?材料制備

2.2.1?NaYF4∶Yb，Er納米粒子的制備及氨基化修飾?參考文獻(xiàn)[23]方法制備上轉(zhuǎn)換NaYF4∶Yb，Er納米粒子。在磁力攪拌下，將5 mL含1 mmol LnCl3（Ln=Y∶Yb∶Er， 80∶18∶2）溶液與2 mmol檸檬酸鈉加入10 mL水中。將5 mL含2.88 mmol NaCl和6 mmol NH4F的水溶液、10 mL油酸和5 mL乙二醇加至上述溶液，充分?jǐn)嚢韬筠D(zhuǎn)入50 mL反應(yīng)釜中， 180℃反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，傾出混合液，離心分離后，用乙醇洗滌沉淀物， 并于60℃真空干燥12 h，得到上轉(zhuǎn)換材料NaYF4∶Yb，Er （UCNPs）。

采用反相微乳液法[24]制備氨基修飾的UCNPs粒子（NH2-UCNPS）。將100 mg UCNPs、10 mL環(huán)己烷和1 mL IGEPAL CO-520混合并超聲分散，然后向溶液中依次加入4 mL IGEPAL CO-520和800 μL 氨水，磁力攪拌30 min，緩慢滴加200 μL TEOS，攪拌反應(yīng)12 h。將400 mL KH-602滴加入溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液離心，沉淀物使用乙醇洗滌后，于60℃真空干燥12 h，得到氨基化的上轉(zhuǎn)換納米材料 NH2-UCNPs。

2.2.2?NH2-UCNPS@MIPs的合成?準(zhǔn)確稱取50 mg NH2-UCNPs分散于30 mL去離子水中，超聲分散10 min。加入30 mg PFOS和100 μL N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）進(jìn)行預(yù)組裝。攪拌30 min后，依次加入1.6 mL 0.2 mol/L CTAB和0.2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液。繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min后，依次滴加200 μL 氨水和200 μL TEOS，磁力攪拌下反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液離心，用乙醇-0.1 mol/L HCl （8∶2，V/V）洗脫液將模板分子PFOS和致孔劑CTAB洗脫，然后用去離子水離心洗滌，以去除表面多余的HCl。最后將所得固體粉末置于60℃真空干燥箱中干燥，即得到印跡熒光探針（NH2-UCNPS@MIPs）。非印跡熒光探針NH2-UCNPS@NIPs制備過(guò)程除不加入模板分子PFOS外，其它步驟同上。

2.3?NH2-UCNPS@MIPs對(duì)PFOS的熒光響應(yīng)

于10 mL具塞比色管中加入800 μL NH2-UCNPs@MIPs分散液，再加入100 μL BR緩沖液 （pH=2.9）調(diào)節(jié)體系酸度，混勻，加入不同濃度的PFOS標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水定容至10 mL，于室溫下放置10 min。在激發(fā)波長(zhǎng)980 nm下，測(cè)量體系的熒光光譜，根據(jù)545 nm處的熒光強(qiáng)度的變化值實(shí)現(xiàn)對(duì)PFOS的定量檢測(cè)。

2.4?樣品預(yù)處理

采樣用器皿需預(yù)先使用甲醇、去離子水清洗，使用前需用樣品水體清洗3次。水樣采集后靜置，并加熱煮沸，冷卻至室溫后，用0.20 μm濾膜過(guò)濾3次，以去除水中雜質(zhì)，于4℃儲(chǔ)存，并于24 h內(nèi)完成測(cè)定。血清樣品在室溫下以10000 r/min離心10 min，在上清液中添加乙腈（CH3CN∶血清=1∶1，V/V），渦旋2 min，以10000 r/min離心10 min，去除血清中的蛋白。將上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液，于4℃儲(chǔ)存，并于24 h內(nèi)完成測(cè)定。

3?結(jié)果與討論

3.1?NH2-UCNPS@MIPs的制備

NH2-UCNPS@MIPs材料制備以及檢測(cè)PFOS的原理如圖1所示。通過(guò)溶劑熱法制備水分散性和發(fā)光性能良好的上轉(zhuǎn)換粒子NaYF4∶Yb，Er，在其表面包覆一層SiO2，并修飾硅烷化試劑KH-602，得到表面含有豐富氨基基團(tuán)的UCNPS粒子，即NH2-UCNPS。以NH2-UCNPS為支撐材料和熒光信號(hào)源，PFOS為模板分子，BSTFA為功能單體，CTAB為致孔劑，TEOS為交聯(lián)劑，在堿性條件下引發(fā)NH2-UCNPS表面形成對(duì)PFOS具有特異性識(shí)別位點(diǎn)的介孔二氧化硅薄層，使用洗脫液去除PFOS和CTAB后，得到介孔分子印跡熒光探針NH2-UCNPs@MIPs。 模板和致孔劑洗脫前，非印跡材料的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于印跡材料; 洗脫完全后， 非印跡材料的熒光強(qiáng)度保持不變，印跡材料的熒光強(qiáng)度得以恢復(fù)，以此可以判斷模板和致孔劑得以完全去除。熒光材料所具有的介孔結(jié)構(gòu)使其具有大的比表面積，增大了對(duì)PFOS的吸附量，加快了傳質(zhì)速率。

3.2?NH2-UCNPS@MIPs表征

3.2.1?NH2-UCNPS@MIPs形貌表征?NH2-UCNPS和NH2-UCNPS@MIPs的形貌通過(guò)掃描與透射電鏡進(jìn)行表征。掃描電鏡圖如圖2A和2B所示，兩種材料均呈扁平六棱柱狀，尺寸分布均勻，分散性較好，平均粒徑為1.5 μm。由透射電鏡圖（圖2C）可知，NH2-UCNPS表面有球狀顆粒覆在表面，這是由于在UCNPS表面包覆SiO2時(shí)，部分TEOS水解縮合生成SiO2微球。由NH2-UCNPS@MIPs的TEM圖（圖3D）可以估算出，在NH2-UCNPS表面形成約20 nm的印跡層，超薄的印跡層使得NH2-UCNPS@MIPs具有較低的傳質(zhì)阻力和較好的吸附容量，同時(shí)提供大量印跡位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)PFOS的特異識(shí)別。

3.2.2?紅外光譜分析?圖3為NH2-UCNPs（圖3a）、NH2-UCNPs@MIPs（模板洗脫前） （圖3b）、NH2-UCNPs@MIPs（模板洗脫后） （圖3c）和NH2-UCNPs@NIPs（圖3d）的紅外光譜分析結(jié)果。由NH2-UCNPs的紅外吸收曲線可知，798 cm1處小峰對(duì)應(yīng) SiO的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1085 cm1處強(qiáng)而寬的峰對(duì)應(yīng)SiOSi反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，

在1411 cm1處有較弱的CN伸縮振動(dòng)峰， 3432 cm1處有寬的NH伸縮振動(dòng)峰，這些結(jié)果均表明在UCNPs粒子表面包覆SiO2，并在其表面成功修飾氨基基團(tuán)。在NH2-UCNPs表面包覆印跡層后，洗脫模板分子和致孔劑之前，在NH2-UCNPs@MIPS（洗脫前）曲線中出現(xiàn)1485 cm1 的CTAB的CH伸縮振動(dòng)峰，2856和2922 cm1處為亞甲基、甲基的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，表明CTAB被包覆于分子印跡聚合物中。由圖3b可見(jiàn)，在1149和1256 cm1處出現(xiàn)CF的伸縮振動(dòng)峰，且1234 cm1出現(xiàn)PFOS中磺酸根的SO基團(tuán)的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，表明PFOS與材料成功結(jié)合。比較NH2-UCNPs@MIPs（洗脫前后）紅外光譜圖（圖3b和3c）可知， CTAB與PFOS的特征峰消失，說(shuō)明已將CTAB與PFOS較好去除，從而形成具有特異性識(shí)別PFOS介孔結(jié)構(gòu)的熒光探針。 去除模板和致孔劑后的NH2-UCNPs@MIPs紅外光譜并未表現(xiàn)出與NH2-UCNPs@NIPs的明顯差別。

3.2.3?比表面積與孔徑分布分析?由圖4A可知， NH2-UCNPs@MIPs的N2吸附-脫附等溫曲線為典型的Langmuir Ⅳ型曲線，當(dāng)P/P0>0.4時(shí)，出現(xiàn)一個(gè)較寬的滯后環(huán)，表明NH2-UCNPs@MIPs表面孔道具有較窄的孔口。此外，NH2-UCNPs@MIPs的比表面積為38.12 m2/g，孔體積為0.033 cm3/g。由圖4B可知，NH2-UCNPs@MIPs的孔徑分布較寬，主要集中在2～50 nm，介孔的平均孔徑為3.8 nm。NH2-UCNPs@MIPs較大的比表面積和適中的孔徑提高了對(duì)目標(biāo)分子PFOS的優(yōu)異傳遞能力。

3.3?孵化時(shí)間、體系pH值及離子強(qiáng)度對(duì)檢測(cè)的影響

考察了室溫孵化60 min內(nèi)， 孵化時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。由圖5A可知，樣品空白的熒光強(qiáng)度值在60 min內(nèi)基本保持不變（RSD=1.4%），表明其在水溶液中較好的熒光穩(wěn)定性。加入PFOS后，體系的熒光強(qiáng)度在前5 min內(nèi)快速下降，6～8 min內(nèi)熒光強(qiáng)度降低幅度逐漸減緩，在10 min后趨于穩(wěn)定，并在1 h內(nèi)基本保持不變。NH2-UCNPs@MIPs與PFOS的快速結(jié)合主要?dú)w因于材料表面較薄的介孔印跡殼層，較高的傳質(zhì)速率有利于PFOS快速進(jìn)入孔穴與識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅。

體系pH值對(duì)NH2-UCNPs@MIPs與PFOS作用前后體系熒光強(qiáng)度的影響如圖5B所示。在pH 2.8～10.2范圍內(nèi)， NH2-UCNPs@MIPs的熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定，而與PFOS結(jié)合后表現(xiàn)出明顯的熒光猝滅。當(dāng)pH值從2.8增加到6.3時(shí)，兩者的熒光強(qiáng)度差值緩慢降低，隨著pH值繼續(xù)增加到10.2，此差值保持穩(wěn)定。這可能是由于PFOS在水中有較低的pKa（3.27）[25]，帶負(fù)電荷，在酸性條件下，NH2-UCNPs@MIPs表面的氨基發(fā)生質(zhì)子化，通過(guò)靜電作用與PFOS相結(jié)合，同時(shí)，PFOS上的氟原子與探針表面的含氟基團(tuán)發(fā)生FF弱相互作用結(jié)合，從而導(dǎo)致電荷在探針和PFOS兩者之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，使NH2-UCNPs@MIPs發(fā)生強(qiáng)烈的熒光猝滅。隨著溶液pH值增大，雖然NH2-UCNPs@MIPs表面氨基逐漸去質(zhì)子化而使靜電作用逐漸減弱，但由于FF作用的存在，當(dāng)pH>6時(shí)，PFOS仍可與探針發(fā)生相互作用，導(dǎo)致其熒光發(fā)生明顯猝滅。文獻(xiàn)[26，27]報(bào)道的熒光染料尼羅藍(lán)（Nile blue A， NBA）和氮摻雜碳點(diǎn)熒光探針檢測(cè)PFOS均只能在酸性條件下進(jìn)行。本研究構(gòu)建的熒光探針表現(xiàn)出較好的pH值適用范圍，具有較好的實(shí)際應(yīng)用潛能。

考察溶液離子強(qiáng)度對(duì)檢測(cè)體系熒光猝滅的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)， 體系的熒光猝滅值在0.1～0.6 mol/L NaCl溶液中十分穩(wěn)定，因此體系選擇不加入NaCl。根據(jù)文獻(xiàn)[16，28]報(bào)道，基于靜電相互作用構(gòu)建的異硫氰酸熒光素酯熒光團(tuán)的二氧化硅印跡探針（FITC-APTS-SiO2）和健那綠B熒光探針檢測(cè)PFOS時(shí)，響應(yīng)信號(hào)受離子強(qiáng)度影響較大。本研究制備的熒光探針具有較好的鹽耐受度，說(shuō)明檢測(cè)PFOS過(guò)程中FF作用可能占主導(dǎo)作用。

3.4?NH2-UCNPs@MIPs作為熒光探針檢測(cè)PFOS

NH2-UCNPs@MIPs的熒光猝滅值與PFOS加入濃度的關(guān)系可用Stern-Volmer方程[29]擬合：

其中，F(xiàn)0和F為PFOS不存在和存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，Cq為PFOS的濃度，Ksv為體系的猝滅常數(shù)。將（F0/F）-1定義為猝滅量，NH2-UCNPs@MIPs與NH2-UCNPs@NIPs的Ksv的比值定義為印跡因子（IF），用于評(píng)價(jià)熒光探針的選擇性。

分別在中性和酸性條件下檢測(cè)不同濃度PFOS存在下的體系熒光光譜，并進(jìn)行Stern-Volmer方程線性擬合，結(jié)果見(jiàn)圖6。當(dāng)PFOS濃度在0.01～15 nmol/L之間時(shí)，隨著其濃度增加，體系的熒光猝滅程度均逐漸增強(qiáng)。在溶液中，PFOS導(dǎo)致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅，可歸因于其高的電負(fù)性和CF鍵與其表面的氨基與含氟基團(tuán)發(fā)生的靜電和FF相互作用。由圖6A和6B可知，在pH=7.1時(shí)，NH2-UCNPs@MIPs檢測(cè)PFOS的IF為1.82。當(dāng)溶液pH=3.4時(shí)，NH2-UCNPs@MIPs與PFOS作用后熒光猝滅程度相對(duì)更大（圖6C），線性相關(guān)方程為（F0/F）-1= 0.8559CPFOS+ 0.0402 （R2=0.9958）。結(jié)合非印跡材料的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算得到IF=3.63。以上結(jié)果表明，在中性和酸性條件下，所構(gòu)建的熒光探針均可較好地測(cè)定PFOS，且在酸性條件下探針的選擇性更強(qiáng)，兩種條件下方法的檢出限均可達(dá)到0.01 nmol/L（S/N=3）。

與目前文獻(xiàn)報(bào)道的一些分子印跡熒光探針用于典型全氟化合物PFOS或全氟辛酸（PFOA）的檢測(cè)方法比較（表1），本研究構(gòu)建的熒光探針并主要通過(guò)FF相互作用對(duì)PFOS進(jìn)行檢測(cè)， pH適用范圍廣，且檢出限低、線性范圍寬，所使用發(fā)光材料具有低細(xì)胞毒性和高穿透深度，光化學(xué)穩(wěn)定性高，顯示出良好的應(yīng)用前景。