劉 熔，王昌敏，郝立君，盧佩佩，李智偉

布魯菌病是全球最常見的人獸共患病之一[1]。布魯氏菌導(dǎo)致的感染如得不到及時(shí)診斷和規(guī)范治療常會(huì)導(dǎo)致慢性化，有時(shí)甚至是終身的。目前關(guān)于布魯菌病轉(zhuǎn)變?yōu)槁誀顟B(tài)的原因仍不明確。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在布魯氏菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。Treg細(xì)胞是發(fā)揮免疫抑制的重要細(xì)胞，可以預(yù)防感染過(guò)程中的免疫病理?yè)p害和抵御過(guò)度活躍的免疫反應(yīng)對(duì)宿主的傷害，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，IL-10是Treg 細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種重要的抗炎免疫抑制細(xì)胞因子[3]。本文通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，熒光定量PCR和Aimplex方法評(píng)估Treg細(xì)胞，F(xiàn)oxp3的mRNA表達(dá)及IL-10水平在布魯氏菌感染中的變化特點(diǎn)和相關(guān)性。為布魯菌病的免疫應(yīng)答機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為布魯菌病的治療尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年6-12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診并明確診斷為布魯菌病的患者49例，其中急性期20例，慢性期29例，分別設(shè)立急性布病組和慢性布病組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合WS 269-2019《布魯菌病診斷》的標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、骨關(guān)節(jié)痛、全身乏力等，虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)進(jìn)行初篩陽(yáng)性和試管凝集試驗(yàn)(SAT)檢測(cè)血清中抗布魯氏菌特異性抗體，滴度≥1∶50者。同期募集52例健康體檢人群作為正常對(duì)照組，性別年齡與急、慢性布病組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3組人員均進(jìn)行了虎紅平板試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)，急、慢性布病組發(fā)熱時(shí)進(jìn)行血培養(yǎng)檢測(cè)。3組人員均排除腫瘤、傷寒、風(fēng)濕熱、結(jié)核、自身免疫病和其他各種感染等疾病的人員。所有人員均簽署知情同意書，本研究經(jīng)過(guò)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意，批準(zhǔn)號(hào)：KY201803742。

1.2儀器與試劑 美國(guó)BD FACS Canto plus流式細(xì)胞儀，美國(guó)Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。美國(guó)BD的CD3 PerCP(552851，SP34-2)，CD4 FITC(550628，L200)，CD25 APC(555434，M-A251)，CD127 PE(561028，HIL-7R-M21)，溶血素(349202)。美國(guó)GE淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(17-5442-02)，北京全式金TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)，凱捷T QuantiNava SYBR Green Kit(208054)，愛信 Trizol試劑(abs9331)。

1.3 方 法

1.3.1樣本處理 采集20例急性布魯菌病患者、29例慢性布魯菌病患者和52例正常對(duì)照組人群的全血標(biāo)本，使用EDTA抗凝。分為3管，1管直接使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞表型和數(shù)量；1管用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Paque密度梯度液(美國(guó)GE)依照說(shuō)明書操作步驟提取PBMC，加入TRLZOL凍入-80 ℃低溫冰箱保存，用于mRNA檢測(cè)；另1管3 000 r/min離心5 min吸取上清轉(zhuǎn)移至EP管，-80 ℃低溫冰箱保存，用于IL-10檢測(cè)。

1.3.2流式檢測(cè) 吸取全血樣本100 μL，分別加入CD3 PerCP 20 μL，CD4 FITC 20 μL，CD25 APC 5 μL，CD127 PE 20 μL。避光室溫放置15 min，加入2 mL溶血素10 min后離心去上清，加入2 mL PBS洗滌離心去上清，加入500 μL PBS，重懸。上BD FACS canto plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FlowJo 10.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3熒光定量PCR檢測(cè) 使用qRT-PCR檢測(cè)Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的mRNA水平。將凍存的標(biāo)本取出，依照說(shuō)明書步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增體系條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，結(jié)果用2-△△Ct相對(duì)定量法，分別對(duì)布魯菌病組與正常對(duì)照組中的目的基因進(jìn)行定量。引物序列由上海生工合成，F(xiàn)oxP3 5′-FGTGGCCCGGATGTGAGAAG-3′；FoxP3 5′-RGGAG-CCCTTGTCGGATGATG-3′；β-Actin-F-5′：CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，β-Actin-R-5′-CT-CCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.3.4IL-10檢測(cè) 將凍存的EP管取出，依照Aimplex試劑盒說(shuō)明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，使用BD FACS canto plus流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光微球，保存流式細(xì)胞儀的FCS數(shù)據(jù)文件，并利用軟件FCAP Array 3.0進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象概況 本研究共納入急性布魯菌病患者20例，年齡26～62歲，平均年齡44.3±8.7歲，慢性布魯菌病患者29例，年齡22～71歲，平均年齡43.1±8.6歲。正常對(duì)照組52人，年齡25～72歲，平均年齡44.7±7.4歲。詳見表1。

表1 急慢性布病組與正常對(duì)照組的基本資料

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+CD25+CD127low的Treg細(xì)胞數(shù)量與表型。結(jié)果見圖1和表2，與正常對(duì)照組相比，急性布病組的Treg細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.87，P=0.01)；慢性布病組Treg細(xì)胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.82，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組Treg細(xì)胞比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.96，P<0.01)。

表2 Treg、Foxp3和IL-10水平

注：A為正常對(duì)照組；B為急性布病組；C為慢性布病組。

2.3熒光定量PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA 使用qRT-PCR檢測(cè)PBMC的Foxp3 mRNA水平。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，急性布病組的Foxp3 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.42，P<0.01)；慢性布病組Foxp3 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.89，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組Foxp3 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.38，P=0.02)，如圖2和表2所示。

注：A Treg比例，B為Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，B為IL-10水平。 與正常對(duì)組相比：②P<0.05，③P<0.01；與急性布病組相比：⑤P<0.05，⑥P<0.01。

2.4IL-10水平檢測(cè)結(jié)果 本研究使用Aimplex法檢測(cè)外周血漿中的IL-10水平。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，急性布病組的IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.90，P<0.01)；慢性布病組IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.42，P<0.01)。與急性布病組相比，慢性布病組IL-10水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.64，P<0.01)，如圖2和表2所示。

2.5Treg細(xì)胞與Foxp3 mRNA，IL-10的相關(guān)性 分析布魯菌病患者的Treg數(shù)量與Foxp3 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性以及Treg數(shù)量與IL-10表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果表明，F(xiàn)oxp3 mRNA和Treg數(shù)量呈正相關(guān)(R=0.72，P<0.01)，IL-10水平與Treg數(shù)量呈正相關(guān)(R=0.71，P<0.01)，如圖3。

注：A為Foxp3與Treg相關(guān)性分析，B為IL-10與Treg相關(guān)性分析

3 討 論

布魯菌病慢性患者較多[4]，免疫機(jī)制不清，給患者身體健康帶來(lái)極大危害。布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生菌，T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵御布魯氏菌感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。宿主無(wú)法抵御布魯氏菌長(zhǎng)期感染的原因可能是由于適應(yīng)性免疫反應(yīng)減弱而導(dǎo)致。CD4+T細(xì)胞參與了適應(yīng)性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[6]，可以通過(guò)分化成不同的亞型調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答，Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制活性的CD4+T細(xì)胞亞群，對(duì)于各種病理和生理學(xué)免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控至關(guān)重要。Treg細(xì)胞除了可抑制外部或自身抗原的過(guò)度免疫反應(yīng)，還可防止多種自身免疫性疾病[7]，最重要的是Treg細(xì)胞也與病原體感染和癌癥相關(guān)的過(guò)度免疫反應(yīng)的負(fù)向控制有關(guān)，在某些情況下可能對(duì)宿主有害，導(dǎo)致慢性感染[8]。布魯氏菌慢性化程度較高的原因可能與Treg細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，在布魯菌病患者的Treg細(xì)胞數(shù)量升高，慢性布病患者升高更為顯著，Hasanjani等[10]也發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在布魯菌病患者中顯著增多的現(xiàn)象，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在布魯氏菌持續(xù)感染中Tregs細(xì)胞保持其抑制功能[11]。因此，研究結(jié)果表明Treg細(xì)胞參與了布魯菌病的發(fā)生和發(fā)展。由于Treg細(xì)胞的增多可以有效抑制炎癥反應(yīng)，Treg細(xì)胞可以增加免疫細(xì)胞上的抑制性表面分子如B7的表達(dá)，并下調(diào)抗原提呈細(xì)胞功能，競(jìng)爭(zhēng)性抑制APC細(xì)胞上的協(xié)同共刺激分子活化。Treg還能抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用[12]。Treg細(xì)胞上表達(dá)的CD25是IL-2的受體，可以有效抑制IL-2的生物學(xué)功能，而IL-2可以促進(jìn)Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖活化[13]。因此，Treg細(xì)胞的這些生物學(xué)功能可能是導(dǎo)致布魯氏菌持續(xù)感染的原因。

Foxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能控制發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]，該轉(zhuǎn)錄因子已被認(rèn)為是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能的主開關(guān)或調(diào)節(jié)器。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxp3的mRNA水平在布魯菌病患者特別是慢性患者中明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明Foxp3在布魯氏菌感染后出現(xiàn)上調(diào)，而Foxp3表達(dá)的高低變化代表了Treg細(xì)胞功能的強(qiáng)弱變化[15]。Foxp3通過(guò)直接或間接激活和抑制數(shù)百個(gè)基因來(lái)控制Treg細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮生物學(xué)功能。

IL-10和TGF-β是Treg細(xì)胞主要釋放的2個(gè)發(fā)揮免疫抑制功能的細(xì)胞因子，以避免機(jī)體產(chǎn)生過(guò)度的免疫反應(yīng)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)布魯菌病組患者的血漿中的IL-10的水平明顯高于健康對(duì)照組，并且IL-10的增高水平與Treg細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，這說(shuō)明Treg細(xì)胞增多并上調(diào)IL-10水平來(lái)發(fā)揮抑制功能。Treg細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生IL-10來(lái)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的功能。Manuel RZ等[16]曾報(bào)道IL-10在布魯氏菌持續(xù)感染中增高。我們前期也報(bào)道了布魯氏菌感染者血清中TGF-β的水平也顯著增高[17]，結(jié)合本文發(fā)現(xiàn)的Treg細(xì)胞比例增加的情況，我們認(rèn)為布魯氏菌感染機(jī)體后，細(xì)菌會(huì)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答向負(fù)向免疫發(fā)展，進(jìn)而延緩宿主對(duì)布魯氏菌的清除，最終導(dǎo)致布病遷延不愈。

我國(guó)北方農(nóng)牧地區(qū)布魯氏菌感染者較多，慢性患者眾多。我們的研究顯示Treg功能表達(dá)過(guò)度可能是布魯氏菌發(fā)生持續(xù)感染的原因之一。布魯氏菌感染后出現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量增多，F(xiàn)oxp3基因表達(dá)上調(diào)以及IL-10水平增高的現(xiàn)象，這些結(jié)果導(dǎo)致了布魯氏菌免疫應(yīng)答的有害作用。通過(guò)本研究我們認(rèn)為布魯氏菌感染機(jī)體后，布魯氏菌會(huì)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答向負(fù)向免疫發(fā)展，進(jìn)而延緩宿主對(duì)布魯氏菌的清除，最終導(dǎo)致布病遷延不愈。通過(guò)抑制Treg細(xì)胞或功能的免疫治療手段已經(jīng)嘗試用于腫瘤等疾病的治療[18]。因此，掌握布病持續(xù)感染時(shí)Treg的變化特點(diǎn)、了解Treg在布魯氏菌中的作用，通過(guò)免疫手段抑制或阻斷Treg數(shù)量和功能有望成為布病免疫治療的潛在靶點(diǎn)，為控制布魯氏菌持續(xù)感染帶來(lái)新的思路。

利益沖突：無(wú)