松突圓蚧及相近種類DNA條形碼特征及系統(tǒng)發(fā)育初探

禹海鑫　馬福歡　孫民琴　李琨淵　郭驍駒

摘要：介殼蟲尤其是檢疫性害蟲——松突圓蚧及相近種類嚴重危害我國的農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)，為豐富蚧蟲的基因條形碼數(shù)據(jù)庫，探索松突圓蚧及相近種類的系統(tǒng)發(fā)育關系，以利于用28S rRNA基因作DNA條形碼快速準確地鑒定這些蚧蟲種類。應用PCR技術擴增10種松突圓蚧及相近種類的28S rRNA序列并進行序列比對，以分析其序列組成變異及堿基替換規(guī)律，最后利用MEGA 5.0構建系統(tǒng)進化樹。結果表明，28S rRNA作為DNA條形碼能夠很好地區(qū)分鑒定10種蚧蟲。

關鍵詞：松突圓蚧;28S rRNA;DNA條形碼;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號： S433.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0111-04

收稿日期：2019-11-29

基金項目：南京海關科技計劃（編號：2018KJ58）。

作者簡介：禹海鑫（1984—），男，河南泌陽人，博士，高級農(nóng)藝師，主要從事植物檢疫、昆蟲分類和昆蟲分子化學生態(tài)學研究。Tel：（0513）68588180，E-mail：haixin.007@163.com。

盾蚧科（Diaspididae）屬于昆蟲綱（Insecta）半翅目（Hemiptera）蚧總科（Coccoidea），是蚧總科中種類較豐富的類群之一，該科蚧蟲往往分布廣、危害大、防控難，且個體微小，易于藏匿，主要以成蟲和若蟲取食寄主植物的幼嫩部位，刺吸植物地上部分的葉片、莖及樹皮等部位汁液進行危害，少部分刺吸植物地下部分的根及塊根，使植物的生長勢頭變弱。它們還可以通過攜帶病原微生物進行傳播，導致植物病害大面積發(fā)生;另外，蟲體排出的蜜露常誘致煤污病的產(chǎn)生，從而影響生物光合作用，對松林資源、自然景觀等生態(tài)影響巨大，不少盾蚧科種類是重要的農(nóng)業(yè)及林業(yè)害蟲[1]。其中，松突圓蚧（Hemiberlesia pitysophila）由于對我國松林能夠產(chǎn)生嚴重危害，被2007 年發(fā)布的《進境植物檢疫性有害生物名錄》列為我國檢疫性昆蟲[2]。

近年來，隨著我國外向型經(jīng)濟的發(fā)展，種苗花卉等貨物的進出口量劇增，國內多個口岸在進境種苗花卉、船舶、集裝箱檢疫工作中也多次截獲到檢疫性松突圓蚧及其近似種類[3]，但該類蚧蟲常常會以卵、若蟲、雄蟲、身體破損等的形式出現(xiàn)，快速準確鑒定相當困難。因此，需要探索新方法來解決傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定中遇到的困境。隨著分子試驗技術的迅猛發(fā)展，利用DNA條形碼研究種類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)成為昆蟲學研究的熱點。常用的DNA條形碼包括線粒體DNA（mitochondrial DNA，簡稱mtDNA）[4]、ITS2[5]、28S[6] 和18S[7]，均已被廣泛應用于蚧蟲的分子鑒定研究中。王玉生利用雙基因條形碼鑒定技術研究我國常見粉蚧類害蟲的種類分布[8]。石晶晶基于分子標記COⅠ、28S、18S實現(xiàn)了對新菠蘿灰粉蚧與菠蘿粉蚧種類的多基因條形碼分子鑒定識別[9]。此外，Geoffrey等對盾蚧科2個亞科 5個族47個屬89個種的91個標本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，該研究是第1次針對盾蚧科類群采用分子生物學方法進行的系統(tǒng)發(fā)育分析，但該研究只收集了盾蚧科中2個主要亞科的標本，不能全面地表現(xiàn)該科中各類群之間的相互關系，其中采集于我國的標本只有1頭[10]。何衍彪等通過對柑橘臀紋粉蚧、大洋臀紋粉蚧、無花果臀紋粉蚧3種近緣種粉蚧的COⅠ序列以及 18S rRNA 和 28S rRNA 基因序列的比對分析后，認為 COⅠ序列的變異程度更高，可以作為這3種近緣種粉蚧鑒別的依據(jù)[11]。

本研究對已獲得的10種松突圓蚧及其近似種類的28S rRNA（28S）基因片段進行測序和對比，分析這些序列的特征及遺傳系統(tǒng)發(fā)育關系，以獲得能夠準確鑒定這些蚧蟲種類的分子方法，為研究其他蚧蟲種類的分子鑒定方法提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 昆蟲標本

本試驗所用的蚧蟲標本由廣東林業(yè)科學研究院、憑祥海關、石家莊海關、南通海關等單位提供，所有標本均經(jīng)南京海關動植食中心實驗室鑒定（表1）。

1.2 提取基因組DNA

采用北京金麥格生物技術有限公司購買的GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒提取各樣品的基因組DNA。提取方法：用雙蒸水沖洗100%乙醇浸泡的蚧蟲樣品（應少于30 mg），轉入1.5 mL離心管中，置于MM400球磨儀研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min離心 10 min。離心后加180 mL裂解緩沖液及20 mL Proteinase K，放于55 ℃水中溫浴10 min。再加 200 mL 無水乙醇、200 mL緩沖液、20 mL磁珠，用磁珠來吸附基因組DNA，然后加500 mL Wash Buffer去雜。最后加20 μL Elution Buffer，靜置5 min后洗脫磁珠就獲得了樣品的基因組DNA溶液[12]。

1.3 28S片段擴增和測序

在ProFlexTM PCR儀（購自ABI公司）上進行PCR反應。反應采用25 μL體系，其中2 μL MgCl2 （25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL，購自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成） 各0.5 μL，加滅菌水至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃保持1 min，設置35個循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min。反應完畢將PCR產(chǎn)物送到南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。本試驗PCR反應采用的引物為D2-3566F和D2-4068（表2）。

1.4 序列分析和建樹

將測得的28S序列導入SeqMan分析軟件中進行拼接及校正。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列， 以確認序列的方向和可信度。再將所測序列全部載入Clustal X 1.83軟件中進行比對[13]。將序列比對結果導入MEGA 5.05軟件中[18]算出蚧蟲種類間的轉換/顛換（R）、變異位點（V）、保守位點（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05軟件采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復1 500次。

2 結果與分析

2.1 DNA凝膠電泳結果

本試驗對10種蚧蟲樣品基因組DNA進行PCR擴增。由圖1可知，10個樣品在720 bp附近均有清晰明亮、特異性好的條帶，且沒有非特異性條帶出現(xiàn)，可滿足后續(xù)基因測序的需要。

2.2 蚧蟲28S序列解析

2.2.1 28S序列特征

將各序列導入MEGA 5.05軟件，均切成同等長度片段（684 bp）。結果表明，共有變異位點、保守位點、自裔位點和簡約信息位點分別為226、454、150、75個。另外，統(tǒng)計所有位點堿基的平均含量（表3）發(fā)現(xiàn)，A的平均含量為16.7%，T（U）的平均含量為21.7%，G的平均含量為340%，C的平均含量為27.7% 。其中，G含量最高，A含量最低，C和G含量較接近，且C+G含量為61.7%，要高于A+T含量（38.4%），表現(xiàn)為明顯的C+G堿基偏嗜，與高A+T含量的昆蟲線粒體基因堿基組成基本特征有所不同[14]。

2.2.2 堿基替換規(guī)律分析

使用MEGA 5.05軟件，計算全體位點及各位點的轉換與顛換值以及其比值，結果表明，全體位點的轉換主要發(fā)生在C與T間，顛換主要發(fā)生在G與C之間，轉換/顛換比值（R值）為1.35。通過對密碼子各位點的分析發(fā)現(xiàn)，轉換主要發(fā)生在密碼子的第1位點上，顛換主要發(fā)生在密碼子的第3位點上。第1、2、3位點的R值分別為1.72、1.45、1.02。無論整體還是密碼子的各位平均21.727.716.734.0638.9

點，其R值均小于2，說明該段序列轉換與顛換未達到飽和，在探索系統(tǒng)發(fā)育樹時應考慮轉換和顛換的發(fā)生比率;且說明該段基因可靠度高，使用該基因得到的進化樹也較為可靠（表4）。

2.2.3 基于28S序列的遺傳距離

基于Kimure 2-parameter 模型分析10種蚧蟲個體的遺傳距離，將轉換與顛換考慮在內，采用Bootstrap值（1 500次）進行檢驗[15]。由表5可知，相近種類的遺傳距離數(shù)值在0.017～0.067之間，其中H.cyanophylli和 H.rapax的距離最小，為0.017;不隸屬于同一個科的種類遺傳距離較遠，數(shù)值一般在0.248～0.347之間，其中C. hesperidum和H. pitysophila的距離最大，為0.347（表5）。結果表明，同隸屬于盾蚧科的松突圓蚧及其相近種類的遺傳距離較小，而隸屬于不同科的種類之間的遺傳差距較大，呈現(xiàn)出較為明顯的遺傳差異性，可將此段序列作為分析及鑒別物種的依據(jù)，此結論與基于COⅠ序列計算的遺傳距離結果相一致。

2.2.4 建立系統(tǒng)發(fā)育樹

利用 MEGA 5.05軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖2可知，H. cyanophylli與H. rapax聚為一小枝，且與H. lataniae聚為一枝;H. pitysophila與H. palmae聚為一小枝，上述2枝又聚為一大枝。而同屬于圓盾蚧亞科（Aspidiotinae）下的圓盾蚧屬種類A. nerii、褐圓盾蚧屬種類C. dictyospermi、蹄圓盾蚧屬種類A. aurantii由近及遠與圓盾蚧亞科種類形成的大枝聚在一起。? 此外， 粉蚧科（Pseudococcidae）種類P. lilacinus、蠟蚧科（Coccidae）種類C. hesperidum明顯位于外枝。上述結果表明，同隸屬于圓盾蚧亞科櫛圓盾蚧屬（Hemiberlesia）下的各個種類親緣關系最近，同隸屬于圓盾蚧亞科不同屬的種類親緣關系次之，而隸屬于不同科的種類間的親緣關系最遠， 這與傳統(tǒng)形態(tài)學分類方法的結果一致。同時，此結果也說明28S基因在蚧蟲種間有很好的Bootstrop支持率，能將同屬的蚧蟲聚在一起，將不同科屬的蚧蟲區(qū)分清楚，從而成功地鑒定出上述10種蚧蟲，因此很適合作為DNA條形碼應用于松突圓蚧及相似種類的分子鑒定工作。

3 結論與討論

28S rRNA基因含有較多既相對保守又有足夠變異的遺傳信息位點，常被當作DNA條形碼用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學研究中[8-9]。Geoffrey等對盾蚧科 2 個亞科 5 個族，47 個屬 89 個種的 91 個標本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 進行了系統(tǒng)發(fā)育分析[10]。該研究是第1次針對盾蚧科類群采用分子生物學的方法進行的系統(tǒng)發(fā)育分析。Deng等以蠟蚧科的 6種蠟蚧為靶標，對比 DNA 條形碼序列與 28S 基因序列在鑒定上述介殼蟲種類上的有效性，結果表明，利用 DNA 條形碼序列鑒定的結果與形態(tài)鑒定的結果一致，更適合應用于同屬介殼蟲鑒定[16]。

近年來，隨著我國外向型經(jīng)濟水平的持續(xù)提升，各口岸進出口種苗花卉量劇增。我國口岸從進口種苗花卉中截獲的蚧蟲種類、數(shù)量也出現(xiàn)了增長，但這些蚧蟲多以卵、若蟲、雄蟲、樣本受損等狀態(tài)出現(xiàn)，用傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法存在著較大的困難。用28S rRNA基因片段作DNA條形碼用于昆蟲種類的分子鑒定，極大程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的缺陷。

本研究通過對松突圓蚧及相近種類共10種蚧蟲的28S基因序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列既可有效區(qū)分蚧蟲種類，又能提供豐富的物種親緣關系信息。建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中包含的信息與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定結果相符。本試驗結果不僅能對蚧蟲28S rRNA基因序列的數(shù)據(jù)庫進行補充和完善，也能為下一步將28S rRNA基因分析方法應用于口岸多種蚧蟲種類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學研究提供基礎。值得關注的是，由于不同的基因含有不同的遺傳進化信息，也具有不相同的遺傳進化速率，因此，在后續(xù)的蚧蟲系統(tǒng)發(fā)育學研究中，為得到更精確的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，還需要在結合多個基因分析，多種成蟲、幼蟲形態(tài)特征及多種建樹方法等方面繼續(xù)努力。

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