一起牛呼吸道疾病綜合征的病原分析與藥敏試驗

鐘舒紅　吳翠蘭　李軍　李常挺　陶立　彭昊　潘艷　蘭美益

摘要：為了解廣西某牛場犢牛呼吸道疾病綜合征的發(fā)病原因，本研究通過細(xì)菌分離與RT-PCR/PCR方法對該牛場病死牛肺臟進行病原分析，并對分離菌進行藥敏試驗。結(jié)果顯示，該牛場發(fā)病牛呼吸道疾病綜合征是由牛支原體、肺炎克雷伯氏菌、化膿隱秘桿菌和大腸桿菌混合感染引起。藥敏試驗結(jié)果顯示，支原體分離株對恩諾沙星、氧氟沙星、強力霉素等中度敏感;肺炎克雷伯氏菌分離株對頭孢曲松、阿奇霉素等中度敏感;大腸桿菌分離株對壯觀霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感;化膿隱秘桿菌分離株對頭孢噻肟、氧氟沙星高度敏感，對壯觀霉素、阿米卡星、泰樂菌素、阿奇霉素等中度敏感;4株分離菌均對所用青霉素類、磺胺類抗生素不敏感。臨床治療可以結(jié)合藥敏試驗結(jié)果選擇喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等3類抗生素聯(lián)合用藥。

關(guān)鍵詞：牛呼吸道疾病綜合征;牛支原體;肺炎克雷伯氏菌;化膿隱秘桿菌;大腸桿菌;混合感染;藥敏試驗;抗生素

中圖分類號： S856.3? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0168-04

收稿日期：2020-02-24

基金項目：廣西科技重大專項（編號：桂科AA17204057）;賀州市科技項目（編號：賀科攻201808027）。

作者簡介：鐘舒紅（1986—），女，廣西臨桂人，碩士，助理研究員，主要從事動物疫病防治與病原學(xué)分子生物學(xué)研究。E-mail：zhongshuhong11@163.com。

通信作者：李 軍，博士，副研究員，主要從事動物疫病防治與病原學(xué)分子生物學(xué)研究。E-mail：jlee9981@163.com。

牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是由宿主本身、病原體和環(huán)境因素（如早期斷奶、長途運輸、混群飼養(yǎng)、養(yǎng)殖密度大和通風(fēng)不良）等綜合因素相互作用引起的牛肺炎、支氣管炎、運輸熱等疾病的通稱，因其高發(fā)病率、高死亡率、造成巨大經(jīng)濟損失的特點，是一種全球范圍內(nèi)嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的疾病[1-2]。該疾病常發(fā)生于犢牛和新引進育肥牛群，并多發(fā)生于秋冬兩季[3]。導(dǎo)致BRDC的細(xì)菌性病原體主要有多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）、化膿隱秘桿菌（Pseudomonas pyogenes）、昏睡嗜血桿菌（Haemophilus lethargicus）、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）等;病毒性病原體主要有牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza type 3 virus，BPIV3）等;牛支原體也可誘發(fā)牛呼吸系統(tǒng)疾病[4-8]。通常情況下，BRDC常由細(xì)菌、病毒和支原體混合感染引起，因而常需要借助實驗室診斷才能確定BRDC病原體類型。

廣西某牛場犢牛陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、發(fā)燒、食欲減退并伴有咳喘、流涕等呼吸道癥狀。急性病例突然倒地，口鼻有白色泡沫流出，并迅速死亡。該牛場前后共有4頭犢牛死亡，剖檢見肺部表面有黃白色壞死灶、間質(zhì)增寬并伴有不同程度的充血、實質(zhì)性肉變;其他臟器無明顯肉眼可見病變。本研究采集病死牛肺臟組織，運用細(xì)菌學(xué)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）等實驗室方法來進行病原檢測，并對分離菌進行藥敏試驗，以期為該病的臨床防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料樣品 廣西某牛場病死牛肺臟組織。

1.1.2 主要試劑 馬血清，購自北京索萊寶科技有限公司;PPLO營養(yǎng)肉湯，購自杭州百思生物技術(shù)有限公司;綿羊血瓊脂營養(yǎng)平板、麥康凱瓊脂平板，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司;DNA/RNA抽提試劑盒、HiFi-Script cDNA合成試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、2×ES Taq MasterMix，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱，購自上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司;顯微鏡，購自尼康映像儀器銷售（中國）有限公司;PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)，購自Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 本研究所用引物序列全部參考吳翠蘭等的研究[9]，并由廣州華大基因科技有限公司合成。引物信息詳情見表1。

1.2.2 病料樣品的細(xì)菌及支原體分離鑒定 將采集的肺臟組織無菌劃線接種于麥康凱瓊脂平板和綿羊血瓊脂營養(yǎng)平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～36 h，挑取單個菌落進行純化培養(yǎng)，并進行革蘭氏染色、鏡檢。并根據(jù)表1中的特異性引物和細(xì)菌16S rRNA通用引物進行PCR鑒定。牛支原體分離培養(yǎng)參照陶立等的研究[10]進行，并將疑似牛支原體株進行PCR鑒定。

1.2.3 病料樣品的RT-PCR/PCR鑒定 嚴(yán)格按試劑盒說明書提取病料DNA、RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用針對牛支原體、肺炎克雷伯氏菌、化膿性隱秘桿菌、多殺性巴氏桿菌、BVDV、IBRV、BPIV3的引物分別進行PCR擴增。PCR擴增體系為25.0 μL：2×ES Taq MasterMix 12.5 μL，模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，退火40 s（退火溫度詳見表1），72 ℃延伸50 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，取7 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%凝膠瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗 用K-B紙片法進行分離菌的體外藥敏試驗，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h（牛支原體為96 h），結(jié)果判斷參照抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）M100-S21文件。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料樣品中細(xì)菌及支原體分離鑒定結(jié)果

在麥康凱瓊脂平板上分離到2種菌落，一種為隆起、大而黏液樣的淡粉紅色菌落，另一種為表面平滑、濕潤的粉色菌落;經(jīng)革蘭氏染色鏡檢2種菌落均為革蘭氏陰性短桿菌;細(xì)菌16S rRNA PCR鑒定結(jié)果顯示，黏液樣的淡粉色菌落為肺炎克雷伯氏菌，另一種為大腸桿菌。綿羊血瓊脂營養(yǎng)平板上分離到表面光滑、濕潤、呈明顯β溶血環(huán)的灰白色小菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性桿菌，經(jīng)細(xì)菌16S rRNA PCR鑒定結(jié)果為化膿隱秘桿菌。經(jīng)過72 h 培養(yǎng)，PPLO支原體固體培養(yǎng)基上長出肉眼可見針尖大小的菌落，在顯微鏡下觀察可見典型的煎蛋樣菌落。

2.2 病料樣品的RT-PCR/PCR鑒定結(jié)果

由圖1可知樣品PCR的檢測結(jié)果。病死牛肺臟組織RT-PCR/PCR檢測結(jié)果顯示，牛支原體、肺炎克雷伯氏菌、化膿隱秘桿菌為陽性，BVDV、IBRV、BPIV3和多殺性巴氏桿菌為陰性。

2.3 分離菌及支原體的藥敏試驗結(jié)果

由表2可知，支原體分離株對恩諾沙星、氧氟沙星、強力霉素等中度敏感，對環(huán)丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、泰樂菌素、阿奇霉素、青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明等不敏感。肺炎克雷伯氏菌分離株對頭孢曲松、阿奇霉素中度敏感，對頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、泰樂菌素、青霉素G、氨芐西林、復(fù)方新諾明、泰樂菌素、強力霉素等不敏感。大腸桿菌分離株對壯觀霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感，對頭孢曲松、頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、泰樂菌素、青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、復(fù)方新諾明、強力霉素等不敏感?；撾[秘桿菌分離株對頭孢噻肟、氧氟沙星高度敏感;對壯觀霉素、阿米卡星、泰樂菌素、阿奇霉素中度敏感，對頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、復(fù)方新諾明等不敏感。

3 討論

牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）是由牛支原體、細(xì)菌和病毒單獨或混合感染導(dǎo)致的牛肺炎、支氣管炎等疾病的統(tǒng)稱。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為高熱（體溫為40.0～41.5 ℃）、精神沉郁、食欲下降、呼吸困難、咳嗽、流涎、眼分泌物增多等。其中，有些病毒單獨感染牛后常為隱性感染，臨床癥狀不明顯，但當(dāng)這些牛只受到應(yīng)激時，機體的抵抗力下降，就會引起繼發(fā)性感染，從而導(dǎo)致牛只的發(fā)病率和死亡率增加[11-12]。在國外與牛支原體混合感染的病原微生物有很多，如溶血性曼氏桿菌、IBRV、BRSV、BPIV3等[13]。國內(nèi)張曉宇研究顯示，我國牛呼吸道疾病綜合征病原體中牛支原體、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、IBRV、BVDV、BPIV3的陽性分離率分別為47.5%、0.7%、0.5%、22.0%、28.0%、12.0%[14]。吳翠蘭等報道顯示，廣西牛呼吸道疾病綜合征病原體中牛支原體、肺炎克雷伯氏菌、大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌、IBRV的陽性分離率分別為28.2%、41.0%、33.3%、20.5%、15.4%、5.1%、12.8%[9]。本研究結(jié)果顯示，該牛場犢牛呼吸道疾病綜合征為牛支原體、肺炎克雷伯氏菌、化膿隱秘桿菌和大腸桿菌混合感染。傅欣玲等報道，江蘇某牛場肉牛呼吸道疾病為BVDV、BPIV3和大腸桿菌混合感染[15];趙文蘋等報道，黑龍江1例牛呼吸道疾病為巴氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染[16]。綜上，不同地區(qū)引起B(yǎng)RDC的病原體不同，這可能是由于各地區(qū)氣候環(huán)境不同從而影響各病原體在各地區(qū)的流行情況，我國南方較北方潮濕多雨，氣溫較高，更適合細(xì)菌的繁殖與生長。

本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，支原體分離株對恩諾沙星、氧氟沙星、強力霉素等中度敏感，對環(huán)丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、泰樂菌素、阿奇霉素、青霉素G、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明等不敏感。肺炎克雷伯氏菌分離株對頭孢曲松、阿奇霉素中度敏感，對頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、泰樂菌素、青霉素G、氨芐西林、復(fù)方新諾明、泰樂菌素、強力霉素等不敏感。大腸桿菌分離株對壯觀霉素、阿米卡星、阿奇霉素等高度敏感，對頭孢曲松、頭孢噻肟、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、泰樂菌素、青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、復(fù)方新諾明、強力霉素等不敏感?；撾[秘桿菌分離株對頭孢噻肟、氧氟沙星高度敏感;對壯觀霉素、阿米卡星、泰樂菌素、阿奇霉素中度敏感，對頭孢曲松、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、強力霉素、青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、復(fù)方新諾明等不敏感。以上結(jié)果表明，4株分離菌均對所用青霉素類、磺胺類抗生素不敏感;對喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類所用抗生素較敏感，臨床治療可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇以上3類抗生素聯(lián)合用藥。

由于牛呼吸道疾病的病原體多樣，目前市面上缺少有效疫苗，迄今為止牛的呼吸道疾病主要靠藥物治療。但是隨著抗生素在畜禽生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的普遍使用，細(xì)菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重[17]，因此建立快速的抗生素耐藥檢測體系、強化獸醫(yī)人員和養(yǎng)殖戶對細(xì)菌耐藥性的認(rèn)識、防止產(chǎn)生新的耐藥菌株、阻止已存在的耐藥性傳播以及研發(fā)和篩選新的抗菌藥物等迫在眉睫[18]。

牛呼吸道疾病對我國養(yǎng)牛業(yè)影響巨大，然而國內(nèi)對牛呼吸道疾病的防治研究相對滯后，我們須要根據(jù)國內(nèi)的實際情況，借鑒國外的防控經(jīng)驗，制定合理的防控策略;同時研究有效的防治疫苗和藥物是今后研究的主要方向，以期開發(fā)有效疫苗和診斷制劑，保障我國養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[15]。

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