超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析氟唑菌酰胺在小麥和土壤中的殘留與消解動(dòng)態(tài)

孫星　楊邦保　閆小龍　王冬蘭

摘要：采用基于分散固相萃取建立起來(lái)的一種農(nóng)藥多殘留快速（quick）、簡(jiǎn)單（easy）、便宜（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）、安全（safe）的分析方法——QuEChERS法進(jìn)行前處理，結(jié)合高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定氟唑菌酰胺在小麥和土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量。氟唑菌酰胺在儀器中檢出限為2×10-3 ng，定量限為0.02 mg/kg。氟唑菌酰胺在小麥籽粒、小麥植株、土壤中的添加回收率分別為90.9%～98.4%、86.7%～93.6%、88.3%～88.7%。氟唑菌酰胺在小麥植株中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型，氟唑菌酰胺在江蘇、河南、吉林3地小麥植株中的半衰期分別為4.4、8.6、3.9 d。氟唑菌酰胺在小麥籽粒、小麥植株、土壤中的最終殘留量分別為<0.02～0.050 mg/kg、0.057～1.152 mg/kg、0.031～0.238 mg/kg。氟唑菌酰胺在小麥籽粒中的最終殘留濃度符合GB 2763—2019 《食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》要求，可以安全使用。

關(guān)鍵詞：氟唑菌酰胺;QuEChERS;HPLC-MS/MS;降解;殘留;小麥;土壤

中圖分類(lèi)號(hào)： S481+.8? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0210-05

收稿日期：2019-12-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0200203）。

作者簡(jiǎn)介：孫 星（1985—），男，江蘇鎮(zhèn)江人，助理研究員，主要從事農(nóng)藥殘留分析研究。E-mail：sun0519@sohu.com。

通訊作者：王冬蘭，研究員，主要從事農(nóng)藥殘留分析研究。E-mail：wangdonglan2013@163.com。

氟唑菌酰胺是甲酰胺類(lèi)化合物，為琥珀酸脫氫抑制劑發(fā)揮作用的殺菌劑，由德國(guó)巴斯夫公司開(kāi)發(fā)[1]，它能抑制孢子的發(fā)芽、芽孢管的伸長(zhǎng)、菌絲體的生長(zhǎng)和孢子的形成，通過(guò)葉面處理或種子處理防治谷物、水果和蔬菜上由殼針孢菌、葡萄孢菌、白粉菌、尾孢菌、柄銹菌、絲核菌引起的病害[2]，可廣泛用于谷物、水果和蔬菜等多種作物[3-4]，目前氟唑菌酰胺的研究方向主要包括辣椒、黃瓜、水稻等的病害防治效果[5-8]，原藥含量分析[9]，在谷物、水果、蔬菜中的液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法[10-15]，闡述土壤中的吸附、遷移，水中的降解特性[16]，而鮮有氟唑菌酰胺在小麥中殘留以及降解動(dòng)態(tài)的報(bào)道。本試驗(yàn)采用基于分散固相萃取建立起來(lái)的一種農(nóng)藥多殘留快速（quick）、簡(jiǎn)單（easy）、便宜（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）、安全（safe）的分析方法——QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行前處理同時(shí)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)[17-19]，研究氟唑菌酰胺在小麥中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量，為氟唑菌酰胺在小麥上的施用劑量和安全間隔期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

所用儀器：Agilent 1290-6470A液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）、R10 v.v.食品切碎攪拌機(jī)（法國(guó)robot coupe公司）、QL-901漩渦混合器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）、Talboys數(shù)顯型多管式漩渦混合器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、百分之一電子天平（常州雙杰電子有限公司）。

所用試劑：99.5%氟唑菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司）、乙腈（HPLC級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆⒁译妫ㄉV級(jí)，德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司）、PSA吸附劑（天津博納艾杰爾科技有限公司）、甲酸（HPLC級(jí)，SIGMA-ALDRICH公司）。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

麥粒樣品：將田間麥穗樣品脫粒，混勻后，用四分法縮分殘留樣品，取2份250 g樣品用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎。

秸桿樣品：將田間植株樣本剪成1 cm以下的小段，混勻后，用四分法縮分殘留樣品，取2份250 g樣品用羅伯特食品攪拌機(jī)加干冰粉碎。

1.2.2 提取與凈化

稱(chēng)取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加25 mL乙腈，組織研磨儀振蕩30 min，經(jīng)5 000 r/min離心，取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，氮?dú)獯抵粮桑? mL色譜乙腈定容，加入0.1 g N-丙基乙二胺（PSA）填料，漩渦振蕩，5 000 r/min離心，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：使用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 mm×50 mm 1.8 μm色譜柱;柱溫35 ℃;進(jìn)樣體積：2.0 μL;流動(dòng)相及洗脫程序如表1所示。

質(zhì)譜條件：使用電噴霧離子源（ESI）;多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），正負(fù)離子切換掃描;毛細(xì)管電壓為3 500 V;干燥氣壓力為1.03×105 Pa;溫度300 ℃;霧化氣壓力為4.48×105 Pa;輔助氣壓力為4.83×105 Pa;采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，采集參數(shù)見(jiàn)表2。

1.3 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2017年3月在江蘇省南京市、吉林省雙遼市、河南省新鄉(xiāng)市進(jìn)行了小麥植株和土壤中氟唑菌酰胺降解動(dòng)態(tài)，小麥籽粒、植株和土壤中的氟唑菌酰胺最終殘留試驗(yàn)，按照NY/T 788—2004《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[20]執(zhí)行，設(shè)有空白對(duì)照區(qū)、低劑量處理區(qū)、高劑量處理區(qū)、消解動(dòng)態(tài)處理區(qū)。

1.3.1 降解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

分別于小麥試驗(yàn)地及空白土壤地均勻施藥。施藥劑量為制劑量202.5 g/hm2，施藥1次，施藥后2 h和施藥后1、3、5、7、10、14、21、30、45 d采樣。植株樣本的采集：隨機(jī)在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)剪取地表以上的全株（去根）1 kg，切碎、混勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，備用。土壤樣本的采集：隨機(jī)取點(diǎn)5～10個(gè)，用土鉆采集0～10 cm的土壤2 kg，除去土壤中的碎石、雜草、植物根莖等雜物，在盆中混合均勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，備用。

1.3.2 最終殘留試驗(yàn)

分別設(shè)低劑量135 g/hm2與高劑量202.5 g/hm2 2個(gè)施藥劑量，施藥2～3次，施藥間隔期7 d。距離最后1次施藥的間隔時(shí)間21、28、35 d采樣。植株樣本采集：用隨機(jī)方式在試驗(yàn)小區(qū)中剪取土表以上的全株1 kg，切碎、混勻后采用四分法留樣500 g，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，粘好標(biāo)簽，備用。小麥籽粒樣本采集：用隨機(jī)方式在小區(qū)中剪取稻穗2 kg，裝入樣本袋中包扎妥當(dāng)，粘好標(biāo)簽，備用。土壤樣本采集：隨機(jī)取點(diǎn)5～10個(gè)，采用土鉆采集0～15 cm的土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，粘好標(biāo)簽，備用。

1.4 計(jì)算公式

氟唑菌酰胺消解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程按公式Ct=C0e-kt計(jì)算，降解半衰期按公式t1/2=ln2/k計(jì)算[21]。式中：t1/2為降解半衰期，k為降解速率常數(shù)，C0為氟唑菌酰胺及硫酮菌唑的初始濃度，Ct為t時(shí)刻氟唑菌酰胺及硫酮菌唑的殘留濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按“1.2.2”節(jié)中所述方法對(duì)空白小麥籽粒、植株和土壤提取凈化得到空白基質(zhì)溶劑，配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg/L，在上述液相色譜/質(zhì)譜條件下測(cè)定，以氟唑菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。其中，小麥籽?；|(zhì)曲線方程為：y=-2 802.2x2+14 215x+5.872，r2=1;小麥植株基質(zhì)曲線方程為：y=-123.27x2+8 009.2x+33.814，r2=1;小麥土壤基質(zhì)曲線方程為：y=-2 484.4x2+9 690.4x+3.897 5，r2=0.999 9。峰面積與溶液濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）條件優(yōu)化

試驗(yàn)中采用乙腈與水的梯度洗脫為HPLC-MS/MS的流動(dòng)相，正掃描反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)氟唑菌酰胺，保證氟唑菌酰胺有較高靈敏度和準(zhǔn)確度。進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，在正離子檢測(cè)方式下，氟唑菌酰胺產(chǎn)生穩(wěn)定的分子離子峰[M]+，即m/z=382.2。進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到氟唑菌酰胺的特征碎片離子為m/z=207和m/z=158.9。選取m/z=207為氟唑菌酰胺的定量離子，m/z=158.9為氟唑菌酰胺的定性離子。

2.3 前處理方法優(yōu)化

乙腈是農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面常用提取溶劑，雖然難以提取農(nóng)作物中糖、蛋白質(zhì)類(lèi)化合物，但對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率[22]，因此選擇乙腈作為本試驗(yàn)提取試劑，以最大限度地提取小麥中的殘留農(nóng)藥，并使提取液中的干擾物較少，以確保目標(biāo)化合物的有效提取。本試驗(yàn)借鑒了QuEChERS凈化方法，比較了PSA、NH2、C18、炭黑（GCB）4種填料在凈化上的效果，研究結(jié)果顯示，GCB填料雖然除雜效果好，但對(duì)氟唑菌酰胺吸附明顯，影響回收率，PSA、NH2、C18綜合效果比較，PSA對(duì)氟唑菌酰胺回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最好，因此本試驗(yàn)選用PSA作為凈化的吸附劑。

2.4 方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

在0.02、0.1、0.5 mg/kg 3個(gè)添加水平下，氟唑菌酰胺在小麥籽粒、小麥植株、土壤中回收率為90.9%～98.4%、86.7%～93.6%、88.3%～88.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.0%、3.8%～6.2%、3.6%～6.0%（表3）。各樣本的添加回收率和變異系數(shù)在允許范圍內(nèi)，符合NY/T 788—2004的要求。在小麥籽粒、小麥植株及土壤中添加氟唑菌酰胺，添加水平為0.5 mg/kg，典型圖譜如圖1所示。

2.5 氟唑菌酰胺消解動(dòng)態(tài)結(jié)果

江蘇、河南、吉林三地中氟唑菌酰胺在植株的原始沉積量分別為1.93、1.32、2.04 mg/kg，在土壤中的原始沉積量分別為0.15、0.20、0.12 mg/kg，植株中殘留量與施藥后間隔時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系，降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程回歸曲線（圖2）。土壤中殘留量與施藥后間隔時(shí)間不呈指數(shù)關(guān)系，這可能與土壤的復(fù)雜環(huán)境有關(guān)，因此未作回歸曲線。江蘇試驗(yàn)點(diǎn)植株消解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=1.472 8e-0.155t，r2=0.912 4，半衰期t1/2=4.5 d;河南試驗(yàn)點(diǎn)植株消解動(dòng)力學(xué)方程為Ct=0.952 9e-0.079t，r2=0.863 5，半衰期t1/2=8.8 d;吉林試驗(yàn)點(diǎn)為植株消解動(dòng)力學(xué)方程Ct=1.137 6e-0.177t，r2=0.849 1，半衰期t1/2=3.9 d。

2.6 氟唑菌酰胺最終殘留測(cè)定結(jié)果

小麥?zhǔn)斋@時(shí)采收，1年3地氟唑菌酰胺在小麥籽粒株中殘留量為<0.020～0.050 mg/kg，小麥植株中殘留量為0.057～1.152 mg/kg，在土壤中殘留量為0.031～0.238 mg/kg（表4）。

3 討果與結(jié)論

本試驗(yàn)采用 QuEChERS 前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS 檢測(cè)技術(shù)，定性、定量研究氟唑菌酰胺在小麥籽粒、小麥植株、土壤中的殘留降解動(dòng)態(tài)和最終殘留量。HPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜的定性離子對(duì)進(jìn)行定性，具有良好的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。因此，此方法具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能滿(mǎn)足有效成分和殘留檢測(cè)的要求。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤動(dòng)態(tài)樣品中氟唑菌酰胺殘留量沒(méi)有規(guī)律，這可能由于土壤環(huán)境復(fù)雜，收獲時(shí)采收的小麥植株殘留量也遠(yuǎn)大于籽粒中殘留量，這可能是由于氟唑菌酰胺為親脂性農(nóng)藥，施藥方式為噴霧，這就導(dǎo)致農(nóng)藥主要附著在小麥植株上。

氟唑菌酰胺在小麥植株中降解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型，土壤中降解動(dòng)態(tài)不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)指數(shù)模型。氟唑菌酰胺在小麥植株中半衰期為3.9～8.6 d，表明氟唑菌酰胺降解較快。以135 g/hm2 推薦劑量及202.5 g/hm2 1.5倍劑量施藥時(shí)，氟唑菌酰胺在小麥籽粒中殘留量為<0.020～0.050 mg/kg，低于我國(guó)規(guī)定的氟唑菌酰胺在小麥上的臨時(shí)最大殘留限量（MRL）[23]（0.3 mg/kg），表明在推薦使用劑量下，在小麥上施用氟唑菌酰胺是安全的。

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