薔薇科果樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

吳靜妍 葛新新 李海英

摘要 薔薇科果樹種類繁多，是果品生產(chǎn)中的極佳選擇。組織培養(yǎng)技術(shù)有利于果樹的種苗繁育、培育新品種及縮短育種時(shí)間，從而成為薔薇科果樹快速繁育的有效途徑。從影響組織培養(yǎng)成敗的幾個(gè)重要因素（外植體的取材部位及時(shí)期、滅菌時(shí)間的控制、培養(yǎng)基及植物激素的選擇），歸納了薔薇科果樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為薔薇科果樹的組培快繁體系建立提供參考。

關(guān)鍵詞 薔薇科果樹;組織培養(yǎng);研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S628 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）21-0010-03

Abstract There are many varieties of Rosaceae fruit trees， which is an excellent choice for fruit production.Tissue culture technology is conducive to breeding fruit trees seedlings，cultivating new varieties and shortening the breeding time， thus becoming an effective way for the rapid propagation of Rosaceae fruit trees.This paper summarized the research progress of tissue culture techniques of Rosaceae fruit trees from several important factors affecting the success of tissue culture （the location and period of explants， the control of sterilization time， the selection of culture medium and plant hormones），in order to provide reference for the establishment of tissue culture and rapid propagation system of Rosaceae fruit trees.

Key words Rosaceae fruit trees;Tissue culture;Research progress

作者簡(jiǎn)介 吳靜妍（1991—） ，女，吉林公主嶺人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事觀賞果樹育種研究。*通信作者，助理研究員，碩士，從事觀賞果樹栽培技術(shù)研究。

收稿日期 2020-04-28;修回日期 2020-06-18

薔薇科果樹種類繁多、適應(yīng)性強(qiáng)，是果品生產(chǎn)中的極佳選擇。隨著市場(chǎng)需求的加大，加快選育品質(zhì)優(yōu)良的果樹品種及提高種苗繁育效率成為當(dāng)務(wù)之急。傳統(tǒng)的果樹育種方法包括引種、實(shí)生選種、雜交育種、輻射誘變和芽變等，但果樹的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、雜合度高、自交不親和等問題，傳統(tǒng)的育種方法存在一定局限性。

植物組織培養(yǎng)是一種無(wú)性繁殖方式，是指在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官、組織、胚胎、細(xì)胞及原生質(zhì)體在人工配制的培養(yǎng)基上給予一定的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其潛伏芽萌發(fā)或誘導(dǎo)愈傷組織形成，最終獲得完整植株[1]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可生產(chǎn)大量的優(yōu)良無(wú)性系，有利于果樹種苗繁育;還可以通過細(xì)胞融合克服遠(yuǎn)緣不親和性障礙，有利于果樹新品種的培育;另外，還可獲得單倍體、二倍體、純合二倍體和其他多倍體，有利于縮短育種時(shí)間[2-4]。近年來，國(guó)內(nèi)外已有一些果樹組織培養(yǎng)相關(guān)的研究報(bào)道[5-10]，但缺乏系統(tǒng)的比較和總結(jié)。筆者從影響組織培養(yǎng)成敗的幾個(gè)重要因素（外植體的取材部位及時(shí)期、滅菌時(shí)間的控制、培養(yǎng)基及植物激素的選擇）歸納了近年來薔薇科常見果樹組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為薔薇科果樹的組培快繁體系建立提供參考。

1 外植體

在植物組織培養(yǎng)中，離體培養(yǎng)的材料器官或組織片段稱作外植體。幼芽、莖段是適合愈傷組織誘導(dǎo)的外植體材料。秦偉[11]研究了新疆蘋果以不同器官為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率，其幼莖的誘導(dǎo)率高于葉、子葉，而誘導(dǎo)根則無(wú)愈傷組織形成。韓沙沙等[12]分別以油桃無(wú)菌苗的莖段、去皮莖段、幼芽及葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，差異顯著，幼芽、莖段、去皮莖段的誘導(dǎo)率分別為65.8%、59.2%、50.0%，而葉片誘導(dǎo)率僅為27.5%。同時(shí)，莖段也是適合誘導(dǎo)潛伏芽萌發(fā)的外植體材料，王婷婷等[13]以蘋果接穗品種SVM-O5扦插苗木莖段為外植體，建立其組織培養(yǎng)體系。

組織培養(yǎng)的成功也受外植體取材時(shí)間的影響，取材時(shí)間過早，芽體剛開始萌動(dòng)，接種后生長(zhǎng)緩慢，取材時(shí)間過晚，內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)積累少且?guī)Ь?，不利于滅菌處理且成活率低。?duì)紅花山楂莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，3月份取材為好，而6月份取材所接種的外植體全部污染[14]。對(duì)于杏扁品種“優(yōu)一”，5月份為最佳取材時(shí)間，3月份取材接種后生長(zhǎng)緩慢，8—10月份取材的外植體會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重褐化[15]。另外，外植體的長(zhǎng)度也是影響成活率的一個(gè)因素，山楂品種“蒙山紅”以莖段為外植體時(shí)，其長(zhǎng)度以1.2～1.5 cm為宜[16]。

2 滅菌

植物組織培養(yǎng)要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件，行之有效的滅菌方法有利于試管苗避免污染。針對(duì)外植體生長(zhǎng)程度、表面帶菌種類和內(nèi)生菌等不同情況，滅菌時(shí)應(yīng)選擇合適的消毒液種類。常用的滅菌劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、過氧化氫、升汞、抗生素和硝酸銀等，其中升汞被認(rèn)為是目前消毒效果最好的。方慶等[17]以桃莖段為外植體，比較75%乙醇、升汞、次氯酸鈉3種滅菌試劑的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用75%乙醇浸泡后，再用升汞處理的效果好于次氯酸鈉，0.15%升汞滅菌9 ?min效果最好。但是，升汞是一種劇毒試劑，滅菌的同時(shí)對(duì)植物材料也有很強(qiáng)的傷害作用，控制合適的滅菌時(shí)間極為重要，一般升汞消毒時(shí)間在4～9 min為宜。劉小芳等[18]以“庫(kù)爾勒香梨”為試驗(yàn)材料研究0.1%升汞的浸泡滅菌時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滅菌5 min時(shí)成活率達(dá)90%。江珊等[19]進(jìn)行了0.1%升汞滅菌處理時(shí)間梯度試驗(yàn)，以桃“保佳俊”外植體為材料，結(jié)果表明，升汞滅菌9 min為最佳時(shí)間。馮莎莎等[15]研究發(fā)現(xiàn)杏扁品種“優(yōu)一”的升汞滅菌最佳處理時(shí)間為8 min，污染率低且萌芽率最高。吳高殷等[20]以山杏莖尖和當(dāng)年生莖段為材料，使用75%乙醇處理30 s，0.2% 升汞滅菌 6 ?min，再用2%NaClO 處理4 ?min，進(jìn)行滅菌，其誘導(dǎo)效果最佳?？拙S龍等[16]以山楂新品種“蒙山紅”莖段為外植體，經(jīng)乙醇處理30 s、升汞處理4 min時(shí)成活率達(dá)100%，污染率為0。

賈海燕等[21]在對(duì)歐李外植體消毒時(shí)，在乙醇和升汞的處理中加入超聲，超聲的空化作用使清洗和消毒更加徹底，可有效降低污染率，依此建立了“歐李快繁體系”。但是升汞的劇毒性質(zhì)，不利于試驗(yàn)操作和廢液處理。Araba等[22]對(duì)于G×N15（杏仁×桃）雜交種的研究表明，NS（納米銀）浸泡或添加到培養(yǎng)基中均可減少內(nèi)部、外部污染，且在培養(yǎng)基中添加NS的效果優(yōu)于浸泡外植體。NS溶液可以用作G×N15微繁殖的低風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑，未來可以作為升汞的合適替代品。

3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是由不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配制而成的，可以給微生物、植物或動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)的基質(zhì)。目前，在果樹組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基有MS、WPM、White、QL、B5等。MS培養(yǎng)基使用較為普遍，其成分中鉀、銨和硝酸鹽的含量均較高;相對(duì)于MS培養(yǎng)基，WPM培養(yǎng)基用硫酸鉀代替了硝酸鉀，硝酸銨的含量也變?yōu)镸S培養(yǎng)基的1/4;White培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低;WPS培養(yǎng)基中鈣離子含量高，含有硝態(tài)氮，無(wú)銨態(tài)氮和碘化鉀;QL培養(yǎng)基組分的主要差異是NH4+含量和NO3-與NH4+比例的不同;B5培養(yǎng)基中銨含量較低，而銨對(duì)不少植物材料的生長(zhǎng)都有抑制作用。

薔薇科果樹初代培養(yǎng)基多選用MS或改良MS培養(yǎng)基效果較好，如MS培養(yǎng)基為“金凱特”杏芽段、杏扁品種“優(yōu)一”的外植體腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基[15，23]。但不同樹種間存在一定差異，如以李品種“紅美麗”的莖段為外植體，QL培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更利于腋芽萌發(fā)[24]。

繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基選擇以MS培養(yǎng)基、QL培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基為主。MS適宜桃“保佳俊”組培苗的繼代培養(yǎng)及歐洲李“紅艷1號(hào)”莖段的增殖培養(yǎng)[19，25]。

但蘋果抗寒半矮化砧木“54-118”、矮化砧木“JM7”的試驗(yàn)結(jié)果均表明，其試管苗雖然在MS培養(yǎng)基上增殖較好，但QL培養(yǎng)基更有利于獲得健壯生長(zhǎng)的綠苗，適合蘋果砧木試管苗的繼代培養(yǎng)[26-27]。對(duì)于“金凱特”杏組織培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)

WPM培養(yǎng)基更適合其芽段增殖快繁及新梢生長(zhǎng)[23]。孫浩元等[28]建立了李杏砧木“St.JulienA”的無(wú)性繁殖技術(shù)體系，發(fā)現(xiàn)WPM培養(yǎng)基對(duì)其外植體再生及芽增殖的影響好于其他類型的基本培養(yǎng)基。另外，桃豫農(nóng)矮化砧木1號(hào)葉片愈傷組織的繼代培養(yǎng)需要添加1.0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基與WPM培養(yǎng)基交替使用[29]。魏明杰等[30]分別用F14 培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基進(jìn)行櫻桃莖尖培養(yǎng)，F(xiàn)14培養(yǎng)基處理?xiàng)l件下，其增殖系數(shù)更高。趙劍波等[31]以桃砧木GF677莖段為外植體，在基本培養(yǎng)基F14上添加不同激素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確立了桃砧木GF677的離體繁殖體系。

生根培養(yǎng)基多考慮降低無(wú)機(jī)鹽濃度的MS培養(yǎng)基。1/2 MS培養(yǎng)基利于李杏砧木“St.JulienA”的生根培養(yǎng)[28]，1/4 MS培養(yǎng)基對(duì)于光葉山楂的生根培養(yǎng)效果良好[32]。生根培養(yǎng)基還可以通過分析植株器官、組織大量元素含量調(diào)配，魏鵬等[33]以“庫(kù)爾勒香梨”莖葉為試驗(yàn)材料，按照Goncalves提出的調(diào)配方法調(diào)配生根培養(yǎng)基中大量元素含量，效果理想。

4 植物激素

基本培養(yǎng)基是保證外植體生存與生理活動(dòng)的最基本物質(zhì)，而細(xì)胞分裂的啟動(dòng)、培養(yǎng)物的形態(tài)建成、芽的分化則離不開植物激素的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。試驗(yàn)證明，當(dāng)分裂素/生長(zhǎng)素的比值較大時(shí)，有利于誘導(dǎo)芽的形成;當(dāng)分裂素/生長(zhǎng)素的比值較小時(shí)，則有利于根的形成[34]。

常用的細(xì)胞分裂素有CTK、KT、ZT、6-BA、BA、CPPU、TDZ等，生長(zhǎng)素有IAA、NAA、IBA等。TDZ被認(rèn)為是木本植物組織培養(yǎng)中活性最強(qiáng)的類細(xì)胞分裂素物質(zhì)，4.5 μmol/L TDZ預(yù)培養(yǎng)可以增加供體枝條葉再生能力[35]。

薔薇科果樹莖尖、莖段、芽的培養(yǎng)中常添加的激素有6-BA、NAA、IBA。楊艷敏等[36]研究發(fā)現(xiàn)6-BA（1.5 mg/L或1.0 mg/L）可提高3個(gè)蘋果矮化品種外植體誘導(dǎo)率及促進(jìn)試管苗增殖和生長(zhǎng)。周春娜[37]研究發(fā)現(xiàn)在巴旦杏的初始誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中添加6-BA、NAA，效果良好;馮莎莎等[15]的試驗(yàn)也證明了6-BA、NAA協(xié)同作用有利于杏扁品種“優(yōu)一”的莖芽增殖。宋健坤等[38]認(rèn)為梨砧木OH×F51莖尖離體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基是MS+2.0 ?mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA，莖尖誘導(dǎo)成苗率最高。生根培養(yǎng)中，單獨(dú)使用低濃度的IBA（0.2 ?mg/L）時(shí)山杏生根率高[20]，而杏扁品種“優(yōu)一”生根率隨著IBA濃度增加呈先增加后下降，0.4 mg/L為最適濃度[15]。方明等[39]研究了梨試管苗的兩步生根法，在1/2 MS+0.2 mg/L IBA 上暗培養(yǎng)7 d+光照培養(yǎng)7 d后，在IBA 0.2 mg/L中蘸根10 s（或15 s），再轉(zhuǎn)移至僅含有1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4種梨試管苗的生根率在40%～90%。

愈傷組織誘導(dǎo)常添加的激素有6-BA、2，4-D 、NAA、TDZ。宋健坤等[38]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基NN69 +3.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA梨砧木OH×F51葉片的出愈率達(dá)98.33%。以油桃?guī)а壳o段為外植體，油桃愈傷組織的誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的升高而升高，NAA、BA影響不大[40]。以桃豫農(nóng)矮化砧木1號(hào)的葉片為外植體，在0～2 mg/L時(shí)2，4-D濃度越高，愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨之升高[29]。吳高殷等[20]研究了山杏莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果表明當(dāng)6-BA與2，4-D 濃度低時(shí)誘導(dǎo)率高，但是后期出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。另外，NAA可促進(jìn)光葉山楂外植體的愈傷組織形成，CPPU 抑制其愈傷組織的形成但不抑制生長(zhǎng)，同時(shí)也證明了CPPU是一種非常有效的細(xì)胞分裂素[32]。

5 其他因素

除以上主要因素與組織培養(yǎng)成功率有一定關(guān)系外，光照條件、氣態(tài)微環(huán)境也可產(chǎn)生影響。如黑暗條件能夠促進(jìn)愈傷組織的形成，“滿園紅”油桃果肉在黑暗條件下誘導(dǎo)出的愈傷組織呈松散狀并生長(zhǎng)良好[40]。崔美等[41]對(duì)以國(guó)光蘋果和富士蘋果的幼嫩葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)14 d最有利于愈傷組織的形成。沙梨種子接種在培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d能促進(jìn)種子萌發(fā)，苗健壯，葉片黃綠[42]。柳金鳳等[43]研究了不同光質(zhì)對(duì)紅花山楂試管苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明紅藍(lán)光7∶9光質(zhì)條件下，最有利于紅花山楂的分化、生根，且移栽后成活率最高。Cati等[44]、Marino等[45]研究杏組織培養(yǎng)中氣態(tài)微環(huán)境的影響，不同類型的密封影響杏芽積累的乙烯和二氧化碳含量，進(jìn)而影響增殖及生根。

6 討論與展望

組織培養(yǎng)因其具有繁殖周期短、培養(yǎng)條件可以人為控制、可直接誘變和篩選出高抗優(yōu)良品種等優(yōu)點(diǎn)，已在苗木快繁、轉(zhuǎn)基因、培養(yǎng)脫毒苗、花藥培養(yǎng)、超低溫種質(zhì)保存等方面廣泛應(yīng)用。薔薇科果樹組織培養(yǎng)技術(shù)已發(fā)展多年并取得不少成就，但仍存在一些問題。污染、褐化、玻璃化等問題會(huì)直接影響組織培養(yǎng)的成敗。

因此，從外植體的選擇、消毒時(shí)間的控制以及培養(yǎng)基、植物激素的選擇，每一環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。目前來看，果樹組織培養(yǎng)多以莖段、莖尖、葉片為外植體，今后可以加大外植體的選擇范圍，同時(shí)進(jìn)一步探索升汞的合適替代品，使植物組織培養(yǎng)安全、無(wú)污染。在解決污染、褐化、玻璃化等問題時(shí)，如何降低成本也是需要考慮的因素，高成本不利于商業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。

今后應(yīng)繼續(xù)加大樹種、品種的研究范圍，為薔薇科果樹的育種和遺傳轉(zhuǎn)化打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，薔薇科果樹的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、生態(tài)價(jià)值及園林應(yīng)用價(jià)值也得到更大程度的發(fā)揮。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2020年

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