李思佳 宋新宇 李文新

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 &三峽大學(xué) 呼吸系統(tǒng)疾病研究所，湖北 宜昌 443003)

據(jù)2018年全球腫瘤數(shù)據(jù)報(bào)道，肺癌已成為最常見的腫瘤之一(占總病例的11.6%)[1]，同時(shí)也是腫瘤死亡的主要原因(占腫瘤總死亡人數(shù)的18.4%)。肺癌是男性患者最常診斷的腫瘤，且在女性腫瘤患者中，肺癌的發(fā)病率也僅次于乳腺癌[1]。近30年來(lái)，由于靶向藥物及放化療的臨床使用，肺癌患者5年生存率逐步提高，但隨即產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)導(dǎo)致患者預(yù)后不良，目前肺癌的5年生存率仍低于30%[2]。因此，明確肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制以及探索新治療靶點(diǎn)仍是肺癌研究的重點(diǎn)和挑戰(zhàn)。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)的發(fā)現(xiàn)為肺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)[3]。CSC是罕見的腫瘤細(xì)胞群體，具有自我更新以及在不同腫瘤環(huán)境中分化為多種細(xì)胞譜系的能力[4]。在染色體水平上，CSC中端粒酶的活性常增強(qiáng)。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，可反復(fù)添加DNA序列以延長(zhǎng)端粒，并通過(guò)延長(zhǎng)其端粒賦予細(xì)胞無(wú)限增殖的能力。另外，抗凋亡信號(hào)通路、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性以及遷移和轉(zhuǎn)移的能力均會(huì)增加。因此，CSC可以介導(dǎo)腫瘤耐藥性并維持腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期存活，但通過(guò)干預(yù)CSC是否可緩解腫瘤多藥耐藥性并提高放化療的療效仍存在爭(zhēng)議[5]。本文將對(duì)肺癌干細(xì)胞的起源、特點(diǎn)、腫瘤標(biāo)志物、信號(hào)通路以及針對(duì)肺癌干細(xì)胞的靶向治療進(jìn)行論述，并對(duì)肺癌干細(xì)胞的應(yīng)用前景進(jìn)行分析。

1 肺癌干細(xì)胞起源

CSC又稱腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells，TICs)，是存在于腫瘤組織中的一類具有較強(qiáng)致瘤性、自我更新、無(wú)限增殖以及分化潛能的細(xì)胞，因其保持干細(xì)胞特性而又被稱為腫瘤干細(xì)胞[6]。CSC由正常組織干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。正常組織干細(xì)胞具有自我更新能力，且生存周期較長(zhǎng)，分為細(xì)胞靜止期、增殖期和分化期。CSC是多種因素長(zhǎng)期誘導(dǎo)、多步累積而產(chǎn)生的。正常情況下，大部分干細(xì)胞處于細(xì)胞靜止期，發(fā)生突變的可能性較小，但當(dāng)干細(xì)胞處于增殖期和分化期時(shí)將大大增加突變發(fā)生幾率。即使大部分突變的干細(xì)胞會(huì)被機(jī)體識(shí)別并清除，但仍有少部分可能會(huì)被保留并繼承下來(lái)。在全能干細(xì)胞分化過(guò)程中，每一階段的干細(xì)胞都可能積累了不同程度的基因突變，而這些基因突變的干細(xì)胞可能因?yàn)槲h(huán)境改變而發(fā)生細(xì)胞增殖和分化的失衡，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤干細(xì)胞[7]。腫瘤干細(xì)胞發(fā)生后可能參與一系列的腫瘤活動(dòng)，例如引發(fā)腫瘤細(xì)胞更新、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、腫瘤滋養(yǎng)血管生成以及放化療耐受性增加等[8]。因此，肺癌干細(xì)細(xì)胞(lung cancer stem cell，LCSC)可能是治療肺癌、減少腫瘤的耐藥性、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要靶點(diǎn)，靶向干預(yù)LCSC可能在源頭上預(yù)防腫瘤的發(fā)生、耐藥以及復(fù)發(fā)。

2 肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物

在臨床診療過(guò)程中如何篩選LCSC一直是備受關(guān)注的話題。研究證明，肺癌干細(xì)胞可以表達(dá)多種干性標(biāo)志物，如CD133、CD44、CD90、CD87、側(cè)群細(xì)胞(side population cells，SP)、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)等[9]。其中經(jīng)典的糖蛋白CD133和CD44是篩選腫瘤干細(xì)胞最常用的表面標(biāo)志物。

2.1 CD133

CD133是一種由prom基因編碼的五次跨膜糖蛋白，分子量大約為120 kDa[10]。在造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等未分化細(xì)胞中?？蓹z測(cè)到CD133的表達(dá)；并且研究發(fā)現(xiàn)CD133在癌組織中的表達(dá)較癌旁及正常組織顯著增高，且與腫瘤細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)[11]。另一研究證明，CD133可通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-induced factor-1α，HIF-1α)的表達(dá)水平促進(jìn)LCSC的轉(zhuǎn)移[12]。CD133廣泛存在于多種CSC中，目前在肝癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌中均被證實(shí)為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，其陽(yáng)性表達(dá)率與腫瘤惡性程度密切相關(guān)[13]。然而，CD133不能單獨(dú)作為鑒定肺癌干細(xì)胞的標(biāo)志，還需同時(shí)聯(lián)合其他的標(biāo)志物進(jìn)行分選，以提高其陽(yáng)性率。

2.2 CD44

CD44是一種廣泛分布的多功能跨膜表面糖蛋白，其作為信號(hào)受體可介導(dǎo)細(xì)胞黏附、增殖、分化、遷移、血管形成和蛋白酶對(duì)接等多種功能，另外它還能夠接受細(xì)胞外基質(zhì)糖基化以及作為透明質(zhì)酸化信息的受體[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移與CD44有密切的關(guān)系，CD44可用于評(píng)價(jià)非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后[15]。Leung等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CD44+非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的分化能力增強(qiáng)。且與CD44-細(xì)胞相比，CD44+細(xì)胞對(duì)順鉑有更強(qiáng)的耐藥性且具有更強(qiáng)的腫瘤干細(xì)胞成瘤能力。但目前CD44能否成為L(zhǎng)CSC的特異性標(biāo)志物還需進(jìn)一步研究。

2.3 SP細(xì)胞表型

SP細(xì)胞是具有CSC特性的一類細(xì)胞，根據(jù)SP細(xì)胞表型分離純化LCSC是目前的主要方法。其內(nèi)膜廣泛表達(dá)有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)，主要包括ABCB1(P-糖蛋白，MDR1)，ABCC1-5(多藥耐藥蛋白，MRP1-5)和ABCG2(乳腺癌耐藥蛋白，BRCP1)等[17]。Ho等[18]從H460、H23、HTB-58、A549、H441、H2170六種肺腫瘤細(xì)胞系中分離出的SP細(xì)胞中均高表達(dá)ABCG2，因此ABCG2被認(rèn)為是SP的主要表型。研究證明，ABCG2在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌等腫瘤中均可作為CSC標(biāo)志物[19]。ABCG2作為膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可利用ATP水解產(chǎn)生的能量將結(jié)構(gòu)上與其不相關(guān)的小分子(例如細(xì)胞毒化療藥物)泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低[20]。因此，腫瘤細(xì)胞的MDR現(xiàn)象可能與SP細(xì)胞的表達(dá)相關(guān)。

3 LCSC的相關(guān)信號(hào)通路

研究表明，正常組織干細(xì)胞的自我更新以及分化能力均受到一些信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，它們失調(diào)或異常激活都會(huì)導(dǎo)致LCSC的形成和腫瘤的發(fā)生[21]。目前發(fā)現(xiàn)與LCSC關(guān)系密切的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要包括Wnt通路、Hedgehog通路和Notch通路等[4]。

3.1 Wnt信號(hào)通路

Wnt通路在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和運(yùn)動(dòng)以及參與多種組織的損傷再生過(guò)程。Wnt配體是一類分泌蛋白，與人類肺癌相關(guān)的Wnt配體主要有Wnt1、Wnt2、Wnt7a、Wnt5a。Wnt通路可分為β-連環(huán)蛋白依賴的經(jīng)典Wnt通路以及β-連環(huán)蛋白非依賴的非經(jīng)典Wnt通路[22]。在腫瘤細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的突變可以導(dǎo)致自身無(wú)法被磷酸化激活和泛素化降解，β-連環(huán)蛋白不僅可在胞漿內(nèi)大量聚集，還可進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的基因，導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖而致癌。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥的A549肺腺腫瘤細(xì)胞系中，Wnt5a可以通過(guò)其介導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt通路增加ALDH陽(yáng)性LCSC的干細(xì)胞特性。

3.2 Hedgehog信號(hào)通路

Hedgehog信號(hào)通路在胚胎發(fā)育的早期發(fā)揮著極為重要的作用，同時(shí)它還與肺癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。Hedgehog通路有三個(gè)同源基因：sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和desert hedgehog(Dhh)，分別表達(dá)Shh、Ihh和Dhh三種蛋白；還有跨膜受體Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)，及其下游的轉(zhuǎn)錄因子為Gli (Gli1-3)[23]。Watkins等[24]發(fā)現(xiàn)，Shh和Gli-1在肺的氣道上皮損傷修復(fù)中高度活躍，50%的SCLC患者腫瘤組織中有Shh和Gli-1表達(dá)，但在NSCLC中僅有10%的表達(dá)。Katoh等[23]還發(fā)現(xiàn)Hedgehog通路可與Wnt通路共同誘導(dǎo)CD133和CD44等干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，還可使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性和耐藥性[25]。

3.3 Notch通路

Notch是廣泛分布于多種細(xì)胞表面的短程通訊系統(tǒng)[26]。哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)了四個(gè)相關(guān)受體(Notch1～4)，以及兩個(gè)配體家族(Delta樣和Jagged樣)。它對(duì)于胚胎生長(zhǎng)過(guò)程和正常成體干細(xì)胞中細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，已在SCLC和NSCLC中觀察到Notch信號(hào)傳導(dǎo)失調(diào)可促進(jìn)CSC的產(chǎn)生和維持[27]。Westhoff等[28]發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，約1/3的樣本存在著Notch通路的變異，并確定兩種變異類型：Numb表達(dá)的缺失和Notch1功能獲得性突變。Numb被認(rèn)為是Notch信號(hào)通路的安全裝置，Numb基因的缺失、突變都可激活Notch通路而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Notch通路和多種轉(zhuǎn)錄因子之間的交流可加強(qiáng)EMT的過(guò)程，使NSCLC獲得更高的運(yùn)動(dòng)性、侵襲力及代謝活力。Sullivan等[17]發(fā)現(xiàn)，利用γ-促分泌酶抑制劑MRK-003阻斷該信號(hào)可以導(dǎo)致肺癌ALDH+細(xì)胞顯著減少，并伴有腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，在體內(nèi)外均抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，這提示Notch通路可以作為L(zhǎng)CSC靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

4 治療

肺癌的傳統(tǒng)治療方式是手術(shù)治療，輔之以順鉑、卡鉑以及奈達(dá)鉑等藥物進(jìn)行化療。在化療初期，患者的定位率以及5年生存率均明顯增加。尤其是SCLC的患者，他們對(duì)化療藥物極其敏感。在晚期SCLC患者中，與非鉑基藥物相比，用鉑基藥物治療的患者年生存率可提高5%[29]。但隨之而來(lái)的是各種先天或后天的耐藥，限制了化療的治療效果。對(duì)目前傳統(tǒng)的肺癌治療具有耐藥性的患者來(lái)說(shuō)，他們的有效治療不僅要針對(duì)異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞，更重要的是針對(duì)肺癌微環(huán)境中的CSC。因此，CSC標(biāo)記不僅可能有助于識(shí)別和隔離這些腫瘤干細(xì)胞亞群，還可以提供特定的靶向治療。

4.1 針對(duì)肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物的靶向治療

CSC中存在多種小RNA(MicroRNA，miRNA)的異常表達(dá)，其中miR-34a可抑制腫瘤細(xì)胞，其類似物可能成為抗腫瘤藥物[30]。靶向miRNA，其靶標(biāo)可構(gòu)成一種或者多種CSC標(biāo)志物，能夠降低肺癌中的藥物耐藥性，從而顯著提高患者的治愈率和5年生存率[29]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除CD133+細(xì)胞中oct-4的表達(dá)，可明顯抑制腫瘤浸潤(rùn)，阻斷CD133+細(xì)胞形成球體并促進(jìn)這些細(xì)胞分化為CD133-，增加CD133+細(xì)胞的放化療效果。另外，Xia等[31]發(fā)現(xiàn)抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體可以減少表達(dá)SP標(biāo)志物細(xì)胞的耐藥性。但ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體在正常細(xì)胞中也有表達(dá)，這些正常干細(xì)胞的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體具有正常的生理作用。因此，針對(duì)性的抑制CSC中表達(dá)的ABC成員可能是更有效的途徑。

4.2 針對(duì)信號(hào)通路的靶向治療

研究發(fā)現(xiàn)Wnt-β-catenin途徑在一些腫瘤的耐藥性和腫瘤原性中發(fā)揮作用，抑制Wnt-β-catenin途徑可能是一種靶向CSC的策略[32]。Sullivan[17]和Liu等[33]發(fā)現(xiàn)，利用γ-促分泌酶抑制劑MRK-003和DAPT(GSI-IX)阻斷Notch信號(hào)通路，在體內(nèi)外均可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，且GSI可顯著增強(qiáng)順鉑的療效。另外，Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑對(duì)不同類型的腫瘤有治療價(jià)值，但Shh抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。

4.3 抑制EMT

EMT過(guò)程對(duì)腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，上述的一些信號(hào)通路會(huì)激活肺癌EMT過(guò)程，使腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性和耐藥性[34]。因此，抑制EMT過(guò)程也是治療肺癌的一種策略。該過(guò)程與高表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的肺癌不良預(yù)后有關(guān)，HGF是Met受體(EMT的有效誘導(dǎo)劑)的天然配體。當(dāng)使用抑制劑PHA-665752和PF-2341066(克唑替尼)阻斷Met磷酸化時(shí)，該表型可以逆轉(zhuǎn)，從而為化療耐受的SCLC提供新的治療靶點(diǎn)[35]?？诉蛱婺崾且环N雙重Met/ALK抑制劑，對(duì)攜帶微管蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合蛋白的患者有明顯的益處[36]。此外，該化合物可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[36]。

5 結(jié)論與展望

由于肺癌的高發(fā)病率以及高死亡率，對(duì)于肺癌治療的突破迫在眉睫。關(guān)于傳統(tǒng)的肺癌治療，如手術(shù)、放療、化療以及靶向治療都是通過(guò)各種方式減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，但是由于多藥耐藥的產(chǎn)生，其治愈率較低，且容易復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出為肺癌提供了更為有效的治療策略，從耐藥發(fā)生的根源解決問(wèn)題。但是由于一些干細(xì)胞標(biāo)志物不止存在于LCSC中，特異性低，所以很難識(shí)別治療靶點(diǎn)。其次，LCSC和正常干細(xì)胞存在一些相似的功能及通路，在治療時(shí)也難以區(qū)分。總之，LCSC理論上雖提供了新的思路，但由此帶來(lái)的挑戰(zhàn)也不容小覷，只有不斷深入探究才能更新肺癌的治療方法，提高肺癌患者的生存率。