李 瑞，張海蓉，張景麗，張宇艷，李若暢

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，昆明 650032

胰腺癌是發(fā)生于胰腺外分泌腺的惡性腫瘤，胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌的主要類型，占80%～90%，其致死率居世界惡性腫瘤中第七位[1]。胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，然而現(xiàn)有的影像學(xué)檢查及血清學(xué)標(biāo)志物難以發(fā)現(xiàn)其微小的轉(zhuǎn)移，80%以上的患者確診為胰腺癌時(shí)已出現(xiàn)明顯的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，喪失了根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)，5年的生存率僅有9%[2-4]。鑒于轉(zhuǎn)移是影響胰腺癌患者預(yù)后的主要原因，明確胰腺癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，探索有效的治療方法是胰腺癌治療中亟待解決的問(wèn)題。外泌體是由多種細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的囊泡結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)外泌體與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文就外泌體在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面進(jìn)行綜述。

1 外泌體概述

幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)論在生理或病理過(guò)程中均會(huì)釋放細(xì)胞外囊泡，細(xì)胞外囊泡又分為胞外體和外泌體；胞外體是通過(guò)向細(xì)胞外萌芽并截取質(zhì)膜表面而形成的囊泡，包括微囊泡、微粒子和直徑為50～1000 nm的大囊泡；外泌體是一種直徑大小為40～160 nm(平均100 nm)的細(xì)胞外囊泡。外泌體來(lái)源于質(zhì)膜的連續(xù)內(nèi)陷最終導(dǎo)致多囊小泡的形成，這些多囊小泡與細(xì)胞內(nèi)的其他囊泡和細(xì)胞器相互作用，從而增加了外泌體成分的多樣性；成熟的細(xì)胞內(nèi)多囊小泡與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)[5]。外泌體中主要包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(非編碼RNA、mRNA和DNA)和代謝產(chǎn)物等生物大分子，并分布于血漿、尿液、唾液和乳汁等各種體液中[6]。目前可通過(guò)超速離心、超濾、尺寸排除色譜、聚合物沉淀法、免疫親和層析法和基于微流體的技術(shù)等方式對(duì)外泌體進(jìn)行分離提純[7]。通常根據(jù)外泌體的大小和來(lái)源來(lái)選擇分離提純方法，但這些方法普遍存在提取效率低、價(jià)格昂貴、特異性較低等不足。

外泌體最早是1983年P(guān)an和Johnstone[8]在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。最初外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞的代謝廢物而未引起重視。近年來(lái)，隨著對(duì)外泌體的深入研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在其表面表達(dá)特定的黏附分子、整合素和四跨膜蛋白，通過(guò)與跨膜受體和配體的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞對(duì)外泌體的吸收；然后以膜融合的方式將蛋白和核酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞中以調(diào)控蛋白質(zhì)表達(dá)和多種信號(hào)通路，從而在維持生理狀態(tài)和疾病進(jìn)展等方面發(fā)揮生物學(xué)作用[9]。其生物學(xué)功能包括參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、抗原遞呈、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等[10]。

2 外泌體與胰腺癌的轉(zhuǎn)移

胰腺癌的轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，通過(guò)血管浸潤(rùn)離開(kāi)原發(fā)部位，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散至全身各部位，然后在轉(zhuǎn)移部位定植的復(fù)雜多步驟過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)外泌體在胰腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；胰腺癌來(lái)源的外泌體通過(guò)作用于鄰近組織誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、促進(jìn)血管生成，在遠(yuǎn)隔器官處參與形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境以及抑制機(jī)體免疫等方式參與胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

2.1 外泌體與胰腺癌腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤細(xì)胞所在的內(nèi)外環(huán)境，由內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，以及分泌到組織間隙的細(xì)胞外基質(zhì)和其他細(xì)胞因子組成的一個(gè)復(fù)雜異質(zhì)性環(huán)境，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[11]。外泌體是腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間信號(hào)傳導(dǎo)的重要媒介。胰腺癌來(lái)源的外泌體通過(guò)作用于腫瘤微環(huán)境，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)血管生成來(lái)介導(dǎo)胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

2.1.1 外泌體誘導(dǎo)EMT EMT是指在正常的生理或病理?xiàng)l件下上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，EMT不僅在胚胎發(fā)育和組織重建發(fā)揮了重要作用，而且是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要開(kāi)端[12]。在EMT下，腫瘤細(xì)胞失去極性和細(xì)胞之間的緊密連接性降低，進(jìn)入低增殖狀態(tài)，遷移侵襲、抗凋亡能力增強(qiáng)以及細(xì)胞外基質(zhì)生成增多[13]。EMT的分子標(biāo)志物是作為上皮標(biāo)志物的E-鈣黏蛋白、細(xì)胞角蛋白缺失，作為間質(zhì)標(biāo)志物的波形蛋白和纖連蛋白表達(dá)增加[14]。腫瘤細(xì)胞具有上皮特征時(shí)有較強(qiáng)的增殖力，而間質(zhì)特征易轉(zhuǎn)移。當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷EMT后，轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官又會(huì)向上皮形態(tài)逆轉(zhuǎn)(稱為間充質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)變)，然后腫瘤細(xì)胞將開(kāi)始在轉(zhuǎn)移部位定植和增殖[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，具有高度侵襲性胰腺導(dǎo)管腺癌來(lái)源的外泌體lncRNA Sox2ot通過(guò)充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA誘導(dǎo) EMT和干細(xì)胞樣特性，促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；lncRNA Sox2ot過(guò)度表達(dá)，與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期和總生存率相關(guān)。Tang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者與健康對(duì)照組之間血清純化外泌體蛋白質(zhì)水平有顯著的差異，通過(guò)用胰腺癌患者的血清純化外泌體處理胰腺癌細(xì)胞(MiaPaCa-2和AsPC-1)，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中鈣黏蛋白表達(dá)顯著降低，波形蛋白表達(dá)顯著增加，證實(shí)了胰腺癌患者血清來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)EMT。最近一項(xiàng)研究[18]發(fā)現(xiàn)，低氧情況下胰腺癌衍生的外泌體能夠激活PTEN/PI3Kγ信號(hào)通路，其次是通過(guò)依賴低氧誘導(dǎo)因子HIF1a或HIF2a的方式激活巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2表型，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT。綜上所述,外泌體通過(guò)誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力，是轉(zhuǎn)移形成的第一步，也是最重要的步驟；因此，靶向原發(fā)部位外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT或許是抗胰腺癌轉(zhuǎn)移治療的關(guān)鍵，但外泌體誘導(dǎo)EMT潛在的機(jī)制尚未完全闡明，仍需更多的研究來(lái)證實(shí)。

2.1.2 外泌體與血管生成和血管通透性 一方面血管的生成為腫瘤細(xì)胞的快速繁殖提供了重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且是腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的重要通道，是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件[19]。腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體在促進(jìn)血管生成中起著重要作用[20]。生理?xiàng)l件下的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能夠維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，但腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體會(huì)打破內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，病理性的促進(jìn)血管生成[21]。另一方面增加血管的通透性也促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中的核酸物質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物活性分子釋放到腫瘤微環(huán)境中，通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成和改變血管通透性來(lái)促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。內(nèi)皮細(xì)胞是一種位于各類器官微毛細(xì)血管床上的異質(zhì)性細(xì)胞團(tuán)，其中人微血管內(nèi)皮細(xì)胞就是其中之一[22]。Shang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞衍生的外泌體中攜帶有miRNA-27a作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)抑制靶基因BTG2的表達(dá)并上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)的水平，從而促進(jìn)胰腺癌中血管的生成。 Chiba等[24]研究中，胰腺癌細(xì)胞釋放的外泌體可以促進(jìn)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌PK-45H細(xì)胞釋放的外泌體通過(guò)依賴HUVEC中的動(dòng)力蛋白內(nèi)吞作用激活內(nèi)皮細(xì)胞中的AKT和ERK1/2激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)血管形成。另外有研究[25]發(fā)現(xiàn)，AsPC-1系胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體且富含花生四烯酸，能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌PGE2和VEGF等，通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞從而促進(jìn)血管生成。四跨膜蛋白Tspan8是在大鼠胰腺導(dǎo)管腺癌衍生的外泌體中發(fā)現(xiàn)的，表達(dá)Tspan8的外泌體與CD49d結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)非VEGF依賴調(diào)控的幾種血管生成相關(guān)基因、趨化因子和受體的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，遷移和成熟[26]。肌鐵蛋白是一種230 kD跨膜C2結(jié)構(gòu)域蛋白，屬于Ferlin蛋白家族，在胰腺癌外泌體中過(guò)度表達(dá)，具有調(diào)控VEGF生成的作用，并參與腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管形成；經(jīng)敲除肌鐵蛋白基因處理的胰腺導(dǎo)管腺癌產(chǎn)生的外泌體誘導(dǎo)HUVEC遷移和增殖能力明顯降低，從而抑制血管生成[27]。另外有研究[28]發(fā)現(xiàn)，外泌體中Circ-IARS在胰腺癌組織中高表達(dá)，Circ-IARS通過(guò)外泌體整合到臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，下調(diào)miRNA-122以及上調(diào)Ras同源基因家族成員A(RhoA) 和RhoA-GTP水平，促進(jìn)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞收縮，并減少緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，從而破壞了內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，導(dǎo)致血管的通透性增加，有利于腫瘤細(xì)胞穿透血管壁發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。綜上所述，胰腺癌來(lái)源的外泌體作用于血管對(duì)胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要的意義；目前關(guān)于外泌體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用大多研究集中在促進(jìn)血管生成作用上，在改變血管通透性方面的研究較少，還需更多的研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，從而為胰腺癌轉(zhuǎn)移的抗血管治療提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

2.2 外泌體參與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成 轉(zhuǎn)移前微環(huán)境是在腫瘤細(xì)胞到達(dá)未來(lái)轉(zhuǎn)移部位之前出現(xiàn)的適合轉(zhuǎn)移瘤存活和生長(zhǎng)的微環(huán)境，腫瘤來(lái)源的外泌體調(diào)節(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的間充質(zhì)細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處定植和增殖[29]。外泌體可以介導(dǎo)鄰近或遠(yuǎn)隔細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，其包含有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的關(guān)鍵因子。Hoshino等[30]研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于胰腺癌的外泌體過(guò)度表達(dá)特異性整合素αvβ5具有一定的靶向性，可以選擇性地黏附于肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)豐富的區(qū)域，進(jìn)而激活Src磷酸化和促炎S100基因的表達(dá)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫抑制性細(xì)胞的招募，以促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成。在小鼠胰腺癌模型中,胰腺導(dǎo)管腺癌衍生的外泌體能夠誘導(dǎo)肝臟轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境形成，外泌體中巨噬細(xì)胞遷移抑制因子能夠誘導(dǎo)肝臟Kupffer細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，進(jìn)而促進(jìn)肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生纖連蛋白，纖連蛋白沉積有助于骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在肝臟中的募集，從而完成了轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[29]。Rana等[31]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性大鼠胰腺癌BSp73ASML的外泌體中miRNA能下調(diào)鈣黏蛋白17，促進(jìn)蛋白酶、黏附分子和其他相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺部或淋巴結(jié)做準(zhǔn)備。綜上所述，外泌體在胰腺癌形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境中起重要作用；因此，可以針對(duì)外泌體在轉(zhuǎn)移微環(huán)境形成的機(jī)制來(lái)尋找治療靶點(diǎn)。

2.3 外泌體與免疫抑制微環(huán)境 當(dāng)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官后, 需要逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視,并抑制機(jī)體對(duì)轉(zhuǎn)移瘤的免疫清除，才能存活下來(lái)。胰腺癌來(lái)源的外泌體傳遞免疫抑制信號(hào)分子能夠促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞的分化和募集，并靶向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育、成熟、活化以及抗腫瘤能力，從而建立免疫抑制微環(huán)境來(lái)維持腫瘤細(xì)胞的增殖。骨髓來(lái)源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一類具有抑制自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的免疫作用以及促進(jìn)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞形成等功能的未成熟骨髓細(xì)胞[32]。胰腺導(dǎo)管腺癌衍生的外泌體中蛋白質(zhì)和miRNA-1260a及miRNA-494-3p通過(guò)依賴smad4的方式來(lái)影響骨髓細(xì)胞中的鈣流量和糖酵解，從而誘導(dǎo)MDSC的形成[33]。Chalmin等[34]在原位胰腺癌小鼠模型注射胰腺導(dǎo)管腺癌Panc02-H7細(xì)胞來(lái)源的外泌體，發(fā)現(xiàn)肝臟MDSC浸潤(rùn)增加，同時(shí)外泌體也觸發(fā)了MDSC中信號(hào)傳導(dǎo)和活化轉(zhuǎn)錄因子3的激活，隨之激活了MDSC的免疫抑制功能，這有助于建立免疫抑制微環(huán)境。胰腺癌外泌體中的miRNA-203能夠下調(diào)樹(shù)突細(xì)胞(DC)中的Toll樣受體4和細(xì)胞因子TNFα和IL-12等，從而削弱DC的免疫功能，而敲除miRNA-203的外泌體可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象[35]。另一項(xiàng)研究[36]發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌衍生的外泌體通過(guò)miRNA-212-3p抑制調(diào)節(jié)因子X(jué)相關(guān)蛋白表達(dá)，使DC無(wú)法激活CD4+T淋巴細(xì)胞，以降低MHC Ⅱ表達(dá)并誘導(dǎo)DC的免疫耐受，這有助于在胰腺導(dǎo)管腺癌微環(huán)境中產(chǎn)生免疫耐受。Zech等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠導(dǎo)管腺癌衍生的外泌體作用于DC和巨噬細(xì)胞會(huì)干擾IL-2活化淋巴細(xì)胞，并通過(guò)抑制AKT/PI3K信號(hào)通路誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡。此外，低氧誘導(dǎo)的外泌體miRNA-301a-3p激活PTEN/PI3Kγ信號(hào)通路，使巨噬細(xì)胞極化到原瘤M2表型，并抑制T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子；極化的M2巨噬細(xì)胞還會(huì)促進(jìn)與胰腺癌免疫抑制巨噬細(xì)胞表型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)胰腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移[18]。Que等[38]通過(guò)裂解和超濾的方式去除外泌體中miRNA，同時(shí)保留補(bǔ)體多肽等蛋白質(zhì)成分，缺失miRNA的外泌體可促進(jìn)DC的增殖及TNFα的產(chǎn)生和穿孔素的分泌，從而增強(qiáng)對(duì)體外胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用，表明外泌體有可能成為胰腺癌的免疫治療的潛在靶點(diǎn)。綜上所述，外泌體通過(guò)介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，參與免疫抑制微環(huán)境的形成，促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，阻斷外泌體介導(dǎo)的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的形成對(duì)胰腺癌的治療有重要意義。

3 總結(jié)

外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，與胰腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；首先外泌體在胰腺癌腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)EMT使腫瘤細(xì)胞獲得高侵襲性和促進(jìn)血管生成有助于腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管進(jìn)入體循環(huán)，外泌體還能定位腫瘤細(xì)胞將要轉(zhuǎn)移的器官，然后參與形成利于轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，并通過(guò)生物活性分子抑制機(jī)體免疫進(jìn)而影響胰腺癌轉(zhuǎn)移。外泌體參與胰腺癌轉(zhuǎn)移的過(guò)程為理解胰腺癌的轉(zhuǎn)移背景提供了新的見(jiàn)解；因此，阻斷或抑制外泌體的生成有望成為胰腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。目前關(guān)于外泌體在胰腺癌轉(zhuǎn)移調(diào)控中的作用研究正處于初始階段，大部分研究主要集中在動(dòng)物模型上及體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)其潛在機(jī)制還需更多的臨床研究來(lái)闡明。此外，由于外泌體體積較小，種類繁多，對(duì)其分析非常困難，目前尚無(wú)經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、標(biāo)準(zhǔn)的外泌體的分離提取技術(shù)，限制了外泌體的研究，外泌體應(yīng)用于臨床實(shí)踐還有很長(zhǎng)的路要走。但隨著外泌體分離提取技術(shù)和基因測(cè)序的快速發(fā)展及人們對(duì)外泌體的深入研究，未來(lái)將會(huì)發(fā)現(xiàn)針對(duì)胰腺轉(zhuǎn)移的有效治療措施，從而改善胰腺癌患者的預(yù)后。