當(dāng)歸腹痛寧滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高

朱琳 劉東升 朱旭江 蘇蕊 姚世霞 賀軍權(quán) 楊平榮

【摘 要】 目的： 提高當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：修改原有當(dāng)歸藥材的薄層鑒別方法;采用氣相色譜法建立二氯甲烷溶劑殘留的檢查項;采用高效液相色譜法建立當(dāng)歸腹痛寧滴丸中主成分藁本內(nèi)酯的含量測定項。結(jié)果：修改后的薄層色譜分離良好，斑點清晰;氣相色譜法檢測當(dāng)歸腹痛寧滴丸中二氯甲烷的最低檢出限為3.15 μg·mL-1;藁本內(nèi)酯在0.1064～2.1290 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9999以上，加樣回收率n=9）為98.0%（RSD=2.6%）。結(jié)論：通過以上實驗所建立的方法簡便可靠，重復(fù)性好，適用于當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸腹痛寧滴丸;當(dāng)歸;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);藁本內(nèi)酯;二氯甲烷溶劑殘留

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）20-0032-07

Improvement of Quality Standard of Danggui Futongning Droplet Pills

ZHU Lin1，2 LIU Dongsheng1，2 ZHU Xujiang1，2 SU Rui1，2 YAO Shixia1，2 HE Junquan1，2 YANG Pingrong1，2

1.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China;

2.Gansu Inspection and testing technical engineering laboratory for Chinese herbal and Tibetan medicine， Lanzhou 730070， China

Abstract：Objective To improve the quality standard of Danggui Futongning Droplet Pills.Methods The TLC（thin layer chromatography） identification method of Angelica sinensis was improved， the detection items of residual dichloromethane solvent were established by gas chromatography， and the content determination method of ligustilide was established by liquid chromatography.Results The TLC of Angelica sinensis was well separated and the spots were clear; The minimum detection limit of dichloromethane in Danggui Futongning droplet pills by gas chromatography is 3.15 μg·mL-1; The calibration curves of ligustilide were in a good linearity，

R>0.999

and the average recovery rate was 98.0% （RSD=2.6%）.Conclusion The method is simple， reliable and reproducible.It is suitable for the quality control of Danggui FuTongning Droplet Pills.

Keywords：Danggui Futongning Droplet Pills; Angelica; Quality Standard; Ligustilide; Residue of Dichloromethane Solvent

當(dāng)歸腹痛寧滴丸具有解痙止痛的功效，主要用于婦女痛經(jīng)、產(chǎn)后宮縮痛、感染性腹瀉引起的急性腹痛、小兒秋季腹瀉等的治療。原標(biāo)準(zhǔn)收載于甘肅省藥品標(biāo)準(zhǔn)1988年版。1998年收載入衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊，此標(biāo)準(zhǔn)沿用至今，此標(biāo)準(zhǔn)中收載性狀、鑒別（當(dāng)歸）和檢查項，標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，不足以控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量。所以有必要提高現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)歸腹痛寧滴丸是以當(dāng)歸揮發(fā)油為主要原料制成的滴丸劑，當(dāng)歸揮發(fā)油的主要成分為苯酞類，其中藁本內(nèi)酯含量最高[1]，藁本內(nèi)酯有很強的解痙、平喘、鎮(zhèn)定作用，臨床上可用于治療支氣管炎和婦科疾病。研究顯示，藁本內(nèi)酯具有良好的改善微循環(huán)作用，可用于防治與微循環(huán)障礙有關(guān)的疾病[2-3]。與當(dāng)歸腹痛寧滴丸功能主治相吻合，因此當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制需定量測定藁本內(nèi)酯的含量，確保藥物的有效性。當(dāng)歸揮發(fā)油是當(dāng)歸經(jīng)水蒸氣蒸餾，再經(jīng)二氯甲烷萃取而得到的，當(dāng)歸腹痛寧滴丸中有可能存在二氯甲烷溶劑殘留，所以需要建立二氯甲烷溶劑殘留檢查項，確保藥物的安全性。在驗證原標(biāo)準(zhǔn)時還發(fā)現(xiàn)原標(biāo)準(zhǔn)中收載的當(dāng)歸薄層鑒別方法[4]，由于展開系統(tǒng)極性太小且點樣量過大，因此修改了當(dāng)歸薄層鑒別項。

1 材料

1.1 儀器 薄層色譜自動點樣儀（CAMAG 半自動點樣儀）;薄層自動成像儀（CAMAG TLC成像儀）;Agilent 7890A（CTC頂空進樣器）氣相色譜儀;Sartorius天平;電子天平（ME-204）;Waters ALLiance e2695 型高效液相色譜儀;e2695 HPLC Pump、2998 DuaLλ Absorbance Detector 和Empower色譜工作站;資生堂CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，島津Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱和Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱; KH-500DE超聲波清洗器（上海超聲波儀器廠）。

1.2 試藥 當(dāng)歸對照藥材（中國藥品生物制品檢定所提供，批號：120927-201014）;藁本內(nèi)酯（上海源葉生物科技有限公司提供，批號：Z23M7B15162，含量：98%）;N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇與乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純;當(dāng)歸腹痛寧滴丸[JP3]（蘭州和盛堂制藥有限公司提供，批號：20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別 原標(biāo)準(zhǔn)中的當(dāng)歸薄層鑒別方法，由于展開系統(tǒng)極性太小，未將對照藥材與樣品中相應(yīng)的斑點最大程度的展開（如圖1A所示），所以調(diào)整展開系統(tǒng)的極性（如圖1B所示）。另外，原標(biāo)準(zhǔn)中點樣量過大，因此調(diào)整點樣量。最終的方法改為：取本品20粒，置乳缽中，加乙醚研磨提取2次，每次10 mL，過濾，揮干乙醚，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材0.5 g，加乙醚5 mL，振搖2 min，分取乙醚液，揮去乙醚，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部 通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙醚（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。

2.2 二氯甲烷溶劑殘留[5-7]

2.2.1 氣相色譜條件 以6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷為固定相的毛細管柱（DB-624，柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為1.8 μm）;柱溫為程序升溫：初始溫度為30 ℃，保持3.5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至100 ℃，再以每分鐘50 ℃的速率升溫至220 ℃，保持5 min（250 ℃ 后運行6 min）;氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度250 ℃;進樣口溫度200 ℃;頂空進樣，頂空瓶平衡溫度為90 ℃，平衡時間30 min，進樣體積300 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取二氯甲烷（色譜級）約30 mg，精密稱定（31.5 mg），加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每l mL含0.3 mg的溶液，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項下的腸溶滴丸，研細，混勻，取本品約3.0 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加人N，N-二甲基甲酰胺5 mL，密封，振搖使溶散，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按制備工藝，提取當(dāng)歸藥材的揮發(fā)油，配制不含二氯甲烷的陰性對照品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對照液，即得。

2.2.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液以及供試品溶液與對照品溶液的混合溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性樣品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的出峰時間未出現(xiàn)相同的峰，且陰性制劑對所測組分無干擾。對照品溶液中，二氯甲烷的理論塔板數(shù)均大于100000，供試品溶液中二氯甲烷峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

2.2.4 線性關(guān)系的考察 取二氯甲烷（色譜級）約30 mg，精密稱定（31.7 mg），加N，N-二甲基甲酰胺稀釋制成每 mL含0.6 mg的溶液，搖勻，作為線性儲備液備用;分別精密量取線性儲備液體1.0、2.5、4.0、5.0、6.0、7.5 mL置10 mL量瓶中，N，N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別測定分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸處理，得到二氯甲烷的回歸方程為Y=94.818X+1.9965（R=0.999），結(jié)果表明，二氯甲烷在 0.0634～0.4755 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取2.2.2項下的對照品溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果二氯甲烷的RSD為2.6%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 檢出限及定量限試驗 將線性項下溶液圖譜進行計算信噪比為10的為定量限，信噪比為3的為檢出限之間。結(jié)果二氯甲烷的檢出限為3.1500 μg/mL，定量限為12.6000 μg/mL。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在0、2、4、8、12、16 h進行測定，記錄峰面積，結(jié)果均未檢出，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取2.2.4項下線性儲備液適量，每三份一組，第一組加入線性儲備液5.0 mL;第二組加入線性儲備液10.0 mL;第三組加入線性儲備液15.0 mL，分別置20 mL量瓶中用2.2.2項下的陰性樣品溶液溶解并稀釋至刻度，按供試品溶液制備方法制備，測定，計算回收率。[JP2]二氯甲烷的平均加樣回收率為97.7%，RSD為2.2%n=9），本方法回收率良好。結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品測定 取10批樣品（批號20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703），按“ 2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄測定結(jié)果。10批樣品均未檢出二氯甲烷溶劑殘留。

2.3 藁本內(nèi)酯的含量測定[8-10]

2.3.1 色譜條件 色譜柱選用資生堂CAPCELL PAK C18 （5μm，4.6 mm ×250 mm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-乙腈-水 （15∶35∶50）為流動相，檢測波長為327nm，柱溫30 ℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備 取供試品，研細，取約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇約40 mL，超聲提取15 min（功率500 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.2 對照品溶液的制備 取藁本內(nèi)酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含藁本內(nèi)酯50 μg，即得。

2.3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制備工藝，配制不含當(dāng)歸油的陰性樣品，并按標(biāo)準(zhǔn)擬定的供試品溶液制備方法制成陰性對照液。

2.3.3 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的出峰時間出相同的峰，且陰性樣品溶液所測組分無干擾。供試品溶液中，藁本內(nèi)酯的理論塔板數(shù)均大于10000，目標(biāo)色譜峰及其相鄰色譜峰的色譜分離度均大于1.5，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的基線分離。對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖3所示。

2.3.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.3.2.2”項下對照品溶液 2、5、10、15、20、30、40 μL注入高效液相色譜儀，在“2.3.1”條件下測定峰面積。以進樣量X， μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到藁本內(nèi)酯回歸方程為：Y=2760000X+3640，R=0.999999;線性范圍為0.1064～2.1290 μg。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。按峰面積計算，結(jié)果藁本內(nèi)酯RSD為0.8%n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號的當(dāng)歸腹痛寧滴丸樣品6份（批號20150703），按“2.3.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，各吸取10 μL進樣，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯含量的 RSD為1.8% n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

[JP3]2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品（批號20150703）溶液，按“2.3.1”項下條件分別在0、4、12、24、48、96 h進行測定，記錄峰面積，結(jié)果藁本內(nèi)酯的RSD為1.2%n=6），表明供試品溶液在96 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取當(dāng)歸腹痛寧滴丸（ 批號 20150703） 9 份，每份0.25 g，分為3 組。按供試品中待測化合物含量的50%，100% 和150% 分別加入對照品溶液（0.1330644 mg/mL、0.443548 mg/mL），按“2.3.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算藁本內(nèi)酯的平均回收率為98.0%，RSD 為2.6%，結(jié)果見表2。

2.3.9 樣品測定 取10批樣品[JP3]（批號20150401、20150402、20150403、20150406、20150407、20150408、20150409、20150701、20150702、20150703），每批2份，按“ 2.3.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，測定含量。結(jié)果見表3。

2.3.10 耐用性試驗（不同色譜柱的影響） 為了考察該含量測定方法的耐用性，實驗分別采用不同和品牌的色譜柱分別測定樣品（批號：20150703）的同一供試品溶液，RSD為1.1%，說明不同色譜柱對其結(jié)果的影響較小。見表4。

3 討論

在藁本內(nèi)酯的含量測定中，分別對以下四種流動相進行了考察：1.甲醇-水2.甲醇-1%醋酸溶液;3.乙腈-水;4.甲醇-乙腈-水。流動相1、2和3均不符合系統(tǒng)適用性要求，1和2不能使藁本內(nèi)酯峰與其左側(cè)峰的分離度達到要求，3不能使藁本內(nèi)酯峰與其右側(cè)峰的分離度達到要求，最后使用三相系統(tǒng)達到了色譜峰的很好分離，繼續(xù)調(diào)整流動相比例，調(diào)整為甲醇-乙腈-水（15∶35∶50），保證主峰出峰時間盡量小的前提下，使主峰達到完全分離。對一批樣品（20150409）分別采用甲醇、乙酸乙酯與三氯甲烷進行提取，三種溶劑的提取效率相似，但考慮到環(huán)保，所以采用甲醇為提取溶劑。

二氯甲烷溶劑殘留檢查項色譜條件的選擇中：比較了不同色譜柱， 如HP-5、Rxi-17和DB-624等， 結(jié)果有的樣品中有雜峰干擾， 有的二氯甲烷與相鄰的峰分離， 最終選擇DB-624（30 m×0.320 mm 1.80 μm） 為分析柱， 并對不同起始柱溫和保持時間 （70 ℃ 7 min、50 ℃ 5 min和30 ℃ 3.5 min） 進行了比較 （后續(xù)升溫速度和保持時間均相同）， 結(jié)果在30℃ 3.5 min的起始溫度條件下， 目標(biāo)峰得到基線分離。依據(jù)中國藥典2015年版規(guī)定，二氯甲烷限量為0.06%。實際樣品中檢測到的二氯甲烷殘留量均遠在藥典規(guī)定的限量以下。方法學(xué)研究結(jié)果顯示本法具有足夠的靈敏度， 可檢出樣品中二氯甲烷的含量分別0.0008%。表明本法能有效控制當(dāng)歸腹痛寧滴丸原料藥中殘留溶劑量。

綜上所述，本實驗采用薄層色譜法和高效液相色譜法對當(dāng)歸腹痛寧滴丸分別進行了定性和定量鑒別，采用氣相色譜法建立二氯甲烷溶劑殘留的檢查項。本方法專屬性強，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于當(dāng)歸腹痛寧滴丸的質(zhì)量控制，為臨床安全科學(xué)用藥提供了指導(dǎo)。

參考文獻

[1]倪竹南，呂圭源，樓招歡， 等. 當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分和藥理作用研究進展 [J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（7）：93-95.

[2]嚴輝， 段金廒， 錢大瑋，等. 我國不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材質(zhì)量的分析與評價 [J].? 中草藥， 2009，40（12）： 1988-1992.

[3]張海勝， 喬華， 常威， 等.? 當(dāng)歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的測定及大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)[J].中成藥， 2014， 36（5）：1068-1071.

[4]國家藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) （中藥成方制劑第十七冊） [S]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1998： 43-43.

[5]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典 （四部） [S]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015：105-109.

[6]秦麗， 胡昌勤， 劉文英. 頂空氣相色譜法測定藥品中殘留溶劑的影響因素考察 [J]. 藥物分析雜志， 2005（7）： 823-826.

[7]申書昌， 云丹， 李飛. 頂空液相微萃取-氣相色譜法測定鹽酸雷尼替丁中二氯甲烷和三氯甲烷的殘留量 [J].色譜， 2009， 27（6）：845-848.

[8]王祝舉， 唐力英， 赫北湘， 等. HPLC測定當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量[J].中國中藥雜志， 2005， 30（21）：1699-1700.

[9]李中文， 孫兆華， 張慧. 超臨界CO2萃取當(dāng)歸揮發(fā)油的研究及藁本內(nèi)酯的HPLC法測定[J].齊魯藥事， 2007， 26（6）：361-363.

[10]周長新，李新華.藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性與溶劑化效應(yīng)的關(guān)系 [J].藥學(xué)學(xué)報， 2001， 36（10）：793-795.

（收稿日期：2020-05-26 編輯：程鵬飛）

基金項目：甘肅省食品藥品科研項目“替代對照品法研究當(dāng)歸系列品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”（青年科技創(chuàng)新2018GSFDA058）。

作者簡介：朱琳（1985-），女，漢族，碩士，主管藥師，研究方向為藥物分析與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhupeizhulin@163.com