李擎天，郭曉奎

1. 上海交通大學醫(yī)學院檢驗系， 上海 200025； 2. 上海交通大學醫(yī)學院全球健康學院， 上海 200025

以細菌為代表的原核生物，在地球上的存在可追溯到30多億年前。以細菌為感染對象的噬菌體是最早的病毒形態(tài)，其歷史被認為同在30億年以上[1]。在地球生物圈里，大約有超過1031個噬菌體顆粒，每個細菌細胞內(nèi)平均約有10個噬菌體[2]。人體細胞、噬菌體、細菌及其他微生物共同組成了人體內(nèi)環(huán)境。因此，噬菌體與細菌的相互作用也持續(xù)影響著人體健康。

噬菌體自1915年被描述、1940年被電鏡觀察到開始，一直被認為是應(yīng)對細菌感染的重要候選制劑。同時，研究噬菌體所獲的成果在生命科學的多項重大發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要的支撐作用，如DNA為遺傳物質(zhì)的論證、基因組測序、噬菌體展示技術(shù)等[3]。21世紀以來，由于細菌對抗生素耐藥情況不斷加劇，傳統(tǒng)抗生素之外的抗菌制劑研究受到越來越多的關(guān)注。噬菌體可隨細菌分裂增殖，也可完全裂解細菌。與此同時，細菌也通過基因和表型的改變形成對抗噬菌體的機制，噬菌體針對細菌的對抗機制又形成自己的“抗細菌抗噬菌體機制”，循環(huán)往復(fù)，綿延不絕。本文從阻止噬菌體吸附、超感染排除(superinfection exclusion，Sie)、限制性修飾(restriction modification，RM)系統(tǒng)、CRISPR-Cas、流產(chǎn)感染(abortive infection，Abi)等方面對細菌抗噬菌體的機制以及噬菌體針對細菌抗性機制的應(yīng)變進行綜述，期望能為細菌耐藥性及抗菌制劑的研究提供參考。

1 細菌抗噬菌體的機制

細菌抗噬菌體的機制涉及噬菌體的感染、增殖、裂解過程(即噬菌體的生活周期)。主要機制為阻止噬菌體吸附、阻止噬菌體 DNA 進入細胞質(zhì)、降解噬菌體的核酸、干擾噬菌體生活周期及阻止噬菌體顆粒釋放、干擾噬菌體的組裝等。

1.1 阻止噬菌體吸附

噬菌體感染宿主的第一步是對宿主的吸附。一些細菌(如銅綠假單胞菌)通過阻止噬菌體吸附來對抗其感染(圖1a)[4]。細菌阻止噬菌體吸附的情況包括：①革蘭陰性細菌分泌外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)，其含有可充當噬菌體受體的外膜蛋白，競爭性隔離細胞外噬菌體顆粒；②噬菌體受體(如銅綠假單胞菌Ⅵ型菌毛)糖基化而隱藏，使噬菌體無法識別；③噬菌體受體被表面結(jié)構(gòu)(如多糖莢膜)屏蔽而無法被噬菌體吸附；④噬菌體自身編碼蛋白與其受體結(jié)合，阻止同類型噬菌體與細菌受體結(jié)合；⑤噬菌體受體基因突變使噬菌體不能結(jié)合；⑥噬菌體受體基因不表達，導致相應(yīng)噬菌體無法感染。

圖1 細菌抗噬菌體的主要機制

1.2 Sie——阻止噬菌體DNA進入細胞質(zhì)

Sie源自一種蛋白，它可阻止噬菌體DNA進入宿主細胞，從而賦予后者針對特定噬菌體的免疫力(圖1b)。 這些蛋白多為膜錨定蛋白或與膜成分相關(guān)。編碼這些蛋白質(zhì)的基因通常存在于噬菌體中，因此Sie在噬菌體-噬菌體相互作用而非噬菌體-宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。

以大腸埃希菌T4噬菌體為例，T4噬菌體具有2個Sie系統(tǒng)，分別由imm和sp編碼。正常情況下，T4噬菌體感染大腸埃希菌時，細菌的肽聚糖層被其gp5編碼的溶菌酶降解，內(nèi)膜蛋白易位，DNA進入細胞質(zhì)中。Sie的情況包括：①已進入裂解周期的T4噬菌體編碼Imm蛋白，與另一種膜蛋白結(jié)合并改變注入部位的構(gòu)象，阻斷其他T4樣噬菌體的DNA進入細胞質(zhì)；②T4噬菌體編碼的Sp蛋白通過抑制噬菌體gp5編碼的溶菌酶活性而阻止肽聚糖降解，使DNA停留在肽聚糖層與外膜之間[5]。

1.3 RM系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)——降解噬菌體的核酸

RM系統(tǒng)是一種普遍存在且極其多樣化的抗噬菌體防御模式。 它們通常由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基轉(zhuǎn)移酶組成。限制性核酸內(nèi)切酶識別短的DNA序列并切割噬菌體DNA。這些序列既存在于細菌宿主中，也存在于入侵的噬菌體中，宿主使用甲基轉(zhuǎn)移酶修飾自己的DNA來避免其被限制性酶識別，從而保護自身基因組。入侵的噬菌體通常不會被甲基化，因此在侵入時會被切割。RM 系統(tǒng)根據(jù)其作用機制和亞基組成分為4型。

以Ⅰ型 RM 系統(tǒng)為例(圖1c)，Ⅰ型RM系統(tǒng)的組分為雜合寡聚復(fù)合物，通常包含2個DNA裂解所需的核酸酶亞基(R)，以及1個指定識別DNA序列的特異性亞基和2個催化甲基化反應(yīng)的甲基轉(zhuǎn)移酶亞基(M)。這些酶識別其特定靶序列的甲基化狀態(tài)。完全甲基化的DNA被認為是細菌基因組的一部分。半甲基化的DNA被識別為新復(fù)制的細菌DNA，甲基轉(zhuǎn)移酶(M)會在輔因子的幫助下進一步甲基化修飾另一條鏈。入侵的噬菌體DNA通常缺乏特異性修飾，因此會被核酸酶(R)識別為外源DNA并被切割[6]。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前廣泛使用的基因編輯技術(shù)的最初來源(圖1d)。噬菌體初次入侵時，Cas1-Cas2 復(fù)合體選擇一部分外源DNA(原間隔序列)整合到宿主的CRISPR陣列中，成為間隔序列。間隔序列隨后被轉(zhuǎn)錄為長的pre-crRNA，并被Cas蛋白或細胞RNase進一步加工為成熟的crRNA。當具有相同或非常相似的原間隔序列的噬菌體感染時，成熟的crRNA與Cas核酸酶組合成效應(yīng)復(fù)合體，識別緊隨原間隔序列后的PAM序列，然后Cas蛋白對與crRNA互補的入侵dsDNA進行切割[7]。

1.4 Abi系統(tǒng)和毒素-抗毒素系統(tǒng)——干擾噬菌體生活周期并阻止噬菌體顆粒釋放

Abi系統(tǒng)是細菌細胞為阻止噬菌體釋放而自我犧牲的過程。它是一種“程序性細胞死亡”，是通過干擾細胞DNA生物合成的基本過程(如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)或誘導膜滲漏來實現(xiàn)的(圖1e)。以表皮葡萄球菌Stk2 Abi系統(tǒng)為例，在溶原性噬菌體進入裂解周期后，其表達的蛋白PacK會觸發(fā)表皮葡萄球菌絲氨酸/蘇氨酸激酶Stk2磷酸化。后者進而引起一系列涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、復(fù)制和代謝的細胞因子磷酸化。這種廣泛的磷酸化可能會破壞細菌基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯途徑，最終導致噬菌體感染周期的流產(chǎn)和細胞死亡[8]。

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)(圖1f)廣泛存在于細菌、古細菌的染色體、質(zhì)粒、噬菌體的基因組上，依靠一個毒素和一個對毒素有拮抗作用的抗毒素組成的二元系統(tǒng)行使防御功能。TA系統(tǒng)的基本特征是抗毒素的不穩(wěn)定性，必須連續(xù)表達才能與毒素保持適當?shù)幕瘜W計量比并中和毒素。TA系統(tǒng)中的毒素可作用于中心法則的多個過程，最終導致細菌生長停滯或休眠。因此， TA系統(tǒng)既可以作為休眠誘導系統(tǒng)也可以作為Abi系統(tǒng)，其結(jié)果取決于一系列因素，包括毒素的作用機制、毒素活性的持續(xù)時間及噬菌體的生命周期。以植物病原體黑脛病菌的質(zhì)粒編碼的Ⅲ型TA系統(tǒng)為例，毒素ToxN為內(nèi)切RNase，抗毒素ToxI為RNA，毒素、抗毒素形成動態(tài)平衡。噬菌體感染可通過抑制ToxIN轉(zhuǎn)錄、防止ToxI折疊和破壞ToxI-ToxN結(jié)合而抑制抗毒素能力，最終導致游離ToxN釋放。大量ToxN降解細胞RNA，導致細菌細胞及噬菌體死亡[9]。

1.5 干擾噬菌體組裝

噬菌體誘導性染色體島(phage-inducible chromosomal islands，PICI)廣泛存在于革蘭陽性和革蘭陰性細菌中，是高度可移動的遺傳元件家族，對基因水平轉(zhuǎn)移、宿主適應(yīng)性和毒力產(chǎn)生具有重要貢獻(圖1g)[10]。

以金黃色葡萄球菌致病島(Staphylococcusaureuspathogenic island，SaPI)為例。在無輔助噬菌體裂解生長情況下，PICI的表達被PICI抑制子抑制而處于一種靜止的前噬菌體狀態(tài)。在輔助噬菌體處于裂解生長周期時，早期會表達一種去阻遏蛋白，導致PICI從宿主染色體上切除，其基因組得以復(fù)制并表達。PICI的表達產(chǎn)物可通過不同機制干擾輔助噬菌體的組裝，如抑制輔助噬菌體晚期基因的表達，調(diào)節(jié)輔助噬菌體衣殼的裝配，使其產(chǎn)生只能與較小的SaPI基因組包裝在一起的衣殼。最終導致PICI基因組被優(yōu)先包裝并防止形成輔助噬菌體顆粒。與革蘭陽性細菌不同，革蘭陰性細菌的PICI由PICI編碼的激活劑誘導，但激活劑的表達需要輔助噬菌體[10-11]。

2 噬菌體針對細菌抗性的應(yīng)變

在細菌產(chǎn)生針對噬菌體抗性機制的同時，噬菌體也相應(yīng)發(fā)生一系列改變。目前發(fā)現(xiàn)噬菌體針對細菌抗性的改變有：適應(yīng)新受體、應(yīng)對RM系統(tǒng)、應(yīng)對Abi系統(tǒng)、應(yīng)對CRISPR-Cas系統(tǒng)以及溶原決策機制等。

2.1 適應(yīng)新受體

細菌通過改變噬菌體結(jié)合受體來抵御噬菌體的結(jié)合，噬菌體也可做出針對性的改變，從而結(jié)合新的受體(圖2a)。噬菌體依賴其尾部的受體結(jié)合蛋白(receptor binding protein，RBP)識別并結(jié)合細菌細胞膜上受體以完成吸附。當細菌細胞膜上受體改變時，噬菌體尾部RBP也發(fā)生相應(yīng)改變，識別并結(jié)合新受體，再次吸附；當細菌細胞膜外形成包膜而掩蓋受體時，噬菌體產(chǎn)生水解酶降解包膜，使受體暴露從而再次吸附。細菌在不同時期、不同條件下可隨機表達受體，相應(yīng)地，噬菌體可修飾尾部受體結(jié)合蛋白，與不同時期和條件下表達的受體結(jié)合，以提高感染率[12]。

圖2 噬菌體針對細菌抗性的應(yīng)變

2.2 應(yīng)對RM系統(tǒng)

細菌產(chǎn)生RM系統(tǒng)來降解噬菌體的核酸，噬菌體則通過減少限制性位點以及抑制修飾酶等途徑實現(xiàn)對細菌降解作用的逃避(圖2b)。一些噬菌體的基因中只有少量限制位點，或者相距太遠而不被宿主的限制性核酸內(nèi)切酶識別；部分噬菌體則通過宿主或自身對基因進行甲基化，此時新合成的DNA將受到保護；噬菌體P1的DarA和DarB蛋白可結(jié)合到噬菌體DNA上遮蓋住限制位點，使限制性核酸內(nèi)切酶無法識別到位點；噬菌體T7的Ocr蛋白模仿靶DNA并隔離限制酶與甲基化酶和限制性核酸內(nèi)切酶結(jié)合而抑制其活性[13]；噬菌體λ的Ral蛋白激活甲基化酶活性并促進對噬菌體DNA的保護[14]；某些噬菌體能編碼水解酶，水解限制性核酸內(nèi)切酶的輔因子從而抑制后者活性。

2.3 應(yīng)對Abi和TA系統(tǒng)

一些被感染的細菌通過“Abi”，以犧牲自我的方式限制噬菌體對鄰近細菌的感染，噬菌體則可以通過基因突變繞過Abi(圖2c)。例如，乳球菌屬某些噬菌體參與核苷酸代謝的基因發(fā)生突變，使得作用于代謝過程的磷酸化細胞因子失去活性，從而繞過Abi系統(tǒng)；噬菌體可編碼在功能上替代細菌抗毒素的分子，抵消毒素活性；噬菌體φTE產(chǎn)生假抗毒素RNA或劫持天然抗毒素ToxI，以在噬菌體感染期間中和毒素ToxN[15]，游離的ToxN減少將抑制Abi過程。

2.4 應(yīng)對CRISPR-Cas系統(tǒng)

細菌可通過CRISPR-Cas系統(tǒng)實現(xiàn)對噬菌體DNA的降解，而噬菌體則針對這一機制的一些關(guān)鍵點(如前間隔序列突變)，抑制CRISPR-Cas效應(yīng)復(fù)合物形成，從而保護自己免受殺滅(圖2d)[14]。例如，噬菌體原間隔序列或PAM序列突變，使得crRNA和靶DNA無法配對，起到干擾CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用；銅綠假單胞菌的溶原性噬菌體能編碼抑制CRISPR-Cas復(fù)合物形成或抑制其活性的蛋白質(zhì)，進而抑制CRISPR-Cas系統(tǒng)[16]?；魜y[11]弧菌中，噬菌體基因組進入細胞后表達病毒源性的crRNA和CRISPR-Cas復(fù)合物，以霍亂弧菌的PICI樣因子(PICI-like elements，PLE)為靶點，噬菌體CRISPR基因座與PLE序列互補，能特異地使CRISPR-Cas系統(tǒng)失活[17]。

2.5 溶原決策機制

噬菌體在感染宿主菌后是否進入溶原周期將受到許多因素的影響[18]。如圖3所示，①當多個噬菌體感染單個宿主菌時，所有感染的噬菌體溶原性的一致 “投票(vote)”對最終建立溶原性十分必要(圖3a)[19]；②前噬菌體可為細菌的基因開關(guān)。噬菌體與細菌基因組融合，從而使后者失活；而當需要噬菌體基因時，便從細菌基因組中切除，重組為功能基因(圖3b)[21]；③噬菌體阻遏基因(repressor，rep)對溶原態(tài)的建立有重要意義。噬菌體整合前，rep包含一個水解標記致使阻遏蛋白水解，促進裂解；噬菌體整合后，水解標記分離，阻遏蛋白穩(wěn)定表達，維持溶原態(tài)(圖3c)；④噬菌體感染宿主可釋放arbitrium肽，胞外arbitrium肽濃度不斷上升，導致噬菌體溶原態(tài)(圖3d)[20]。

圖3 溶原決策機制

3 結(jié)語

噬菌體的研究為生命科學尤其是基于基因組測序的宏基因組研究奠定了重要基礎(chǔ)。噬菌體與細菌的相互作用與它們的共同宿主——人體的健康息息相關(guān)。充分利用組學理論和實驗技術(shù)，進一步探究噬菌體這一古老個體的結(jié)構(gòu)、進化、功能等特點，不僅可為應(yīng)對抗生素耐藥細菌感染提供有力支持，還有望在噬菌體與細菌相互作用的人工干預(yù)、助力生物制品研制和生產(chǎn)進程等方面為促進人類健康開辟新的路徑。