蔣佳紅，李 游，鄧知敏，石媛媛，盧丹陽，楊 嵐，宋煒熙，胡 琦

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208）

原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，有“癌中之王”的稱號，發(fā)病率居我國惡性腫瘤第5 位，是我國第4 大癌癥死亡原因。盡管目前肝癌治療手段可有效治療早期肝癌，但由于肝癌發(fā)現(xiàn)晚、發(fā)展快，患者確診時(shí)往往已到中晚期，臨床僅30%～40%的患者能夠在早期獲得有效治療。外泌體是一種直徑40～150 nm 的胞外囊泡，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA 等生物活性物質(zhì)，其所含成分與來源細(xì)胞密切相關(guān)。近年來，許多研究證明外泌體在肝癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，外泌體在肝癌診斷與治療中具有重要的臨床應(yīng)用潛力。從外泌體入手，或可更加清晰的闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。本文將從外泌體參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制、用于肝癌診斷的可行性以及在中、西醫(yī)治療肝癌中的潛力三方面進(jìn)行總結(jié)，以期為進(jìn)一步研究及應(yīng)用外泌體診治肝癌提供參考。

1 外泌體與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制

1.1 外泌體與肝癌新血管形成 肝癌生長快、易轉(zhuǎn)移，屬于強(qiáng)血管依賴性腫瘤，已有研究證實(shí)肝癌細(xì)胞源性外泌體參與新生血管形成。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）通過誘導(dǎo)自噬或直接形成重塑血流的微管結(jié)構(gòu)對抗瘤內(nèi)缺氧，并且腫瘤微環(huán)境中存在可以促進(jìn)其生長的生長因子，在外泌體的作用下形成正反饋，導(dǎo)致不良預(yù)后。具有CSC 性質(zhì)的CD90+肝癌細(xì)胞來源外泌體可傳遞來源細(xì)胞的lncRNA-H19，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促血管生成表型，并提升細(xì)胞間粘附功能[1]?？寡苌莎煼ㄖ委熀罄^發(fā)性的腫瘤血管形成和腫瘤生長嚴(yán)重限制了臨床肝癌治療效果。曾燁等[2]針對這一情況進(jìn)行了模擬肝癌實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)外泌體在此過程中發(fā)揮了重要作用。血管生成抑制劑在抑制血管形成、促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬的同時(shí)，還誘導(dǎo)富血管生成因子外泌體釋放，這些外泌體顯著促進(jìn)了內(nèi)皮血管生成和肝癌血管生成。

1.2 外泌體與免疫反應(yīng) 免疫抑制是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，腫瘤細(xì)胞源性外泌體通過傳遞腫瘤抗原和介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的相關(guān)蛋白成分，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡、耗竭，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。尹春來[3]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞源性外泌體內(nèi)有大量miRNA146a-5p，能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞耗竭而加快肝癌進(jìn)程。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是人體重要的抗原提呈細(xì)胞，DC 通過活化初始T 淋巴細(xì)胞，啟動人類抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答，CD80 是提供T 淋巴細(xì)胞活化“第二信號”的重要分子。HepG2 肝癌細(xì)胞外泌體可降低DC 表面CD80分子的表達(dá)，并且DC 的成熟標(biāo)記分子CD83 也呈低表達(dá)[4]。提示肝癌細(xì)胞外泌體可能通過誘導(dǎo)全身性免疫功能下降而實(shí)現(xiàn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。肝癌細(xì)胞來源外泌體可通過多種途徑作用于調(diào)節(jié)腫瘤免疫的共刺激分子，實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。程序性死亡配體-1（PD-L1）能夠與表達(dá)在T 細(xì)胞表面的程序性死亡受體-1（PD-1）結(jié)合，抑制T 細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子分泌，負(fù)調(diào)控淋巴細(xì)胞的激活。肝癌細(xì)胞源性外泌體可與PD-1 靶向結(jié)合，PD-L1 表達(dá)上調(diào)，引起T 淋巴細(xì)胞凋亡，并抑制巨噬細(xì)胞活性，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[5]。另外，腫瘤遞送的外泌體可通過STAT3 信號通路增加巨噬細(xì)胞中PD-L1 的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌，從而引起免疫抑制狀態(tài)[6]。

1.3 外泌體與腫瘤微環(huán)境 腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的交流對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，外泌體通過傳遞肝癌相關(guān)物質(zhì)信息，調(diào)節(jié)周圍細(xì)胞，改變腫瘤微環(huán)境，為肝癌細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利環(huán)境。肝癌細(xì)胞來源外泌體通過傳遞miRNA-103 至內(nèi)皮細(xì)胞，降低血管P120 連環(huán)蛋白、內(nèi)皮型鈣黏素以及閉鎖小帶的表達(dá)，削弱內(nèi)皮連接的完整性，進(jìn)而提高血管通透性并促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，外泌體是肝癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞交流的信使。已有研究表明，miR-320a-PBX3 途徑通過抑制MAPK 途徑的激活起到抑制腫瘤進(jìn)展的作用。Li X 等[5]發(fā)現(xiàn)肝癌患者癌組織中成纖維細(xì)胞源性外泌體中的miRNA-320 a 表達(dá)較正常下降，與其直接下游靶標(biāo)PBX3 結(jié)合減少，阻礙MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用減弱，影響細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和MMP2 的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。此外，F(xiàn)ang T 等[8]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞來源的富miRNA-1247-3 p 外泌體靶向作用于B4 GALT3，促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活并分泌IL-6 和IL-8 等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，甚至介導(dǎo)肝癌肺轉(zhuǎn)移。

1.4 外泌體與肝癌耐藥 細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)降低了化療效果，這已成為肝癌化學(xué)治療中的難題。耐藥的發(fā)生由多種機(jī)制共同參與，目前研究表明，外泌體在耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞之間的信號傳遞中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Fu X 等[9]以多藥耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞系為研究對象，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞通過外泌體將miRNA-32-5p 遞送至敏感細(xì)胞，抑制PTEN 進(jìn)而激活胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 途徑，并且通過調(diào)節(jié)血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)肝癌敏感細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥。轉(zhuǎn)化生成因子-β（TGF-β）可降低肝癌細(xì)胞對索拉非尼和阿霉素的敏感性，Takahashi K[10]發(fā)現(xiàn)TGF-β 在降低敏感性的同時(shí)，使lncRNAROR（長鏈非編碼RNA)高度表達(dá)于肝癌細(xì)胞，肝癌細(xì)胞外泌體進(jìn)而攜帶lncRNA-ROR 至周圍細(xì)胞，擴(kuò)大耐藥細(xì)胞范圍。

2 外泌體與肝癌的診斷、預(yù)后

目前，肝癌的主要診斷方法為影像學(xué)檢查、血清分子標(biāo)志物檢測以及病理組織檢查，影像學(xué)檢查及血清分子標(biāo)志物無法對肝癌早期診斷和微小病灶做出明確診斷；病理組織檢查雖能明確診斷，但其成功率受病灶大小、穿刺進(jìn)針路徑等因素影響，且臨床上有出血、疼痛等并發(fā)癥，肝癌早期診斷仍是臨床上面臨的一大問題。

近年來，外泌體用于腫瘤生物標(biāo)志物早期診斷已成為一大研究熱點(diǎn)。屈振等[11]通過提取30 例肝癌患者和10 例健康體檢者血清外泌體，分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者外泌體miRNA-665 表達(dá)顯著上升，且miRNA-665 表達(dá)程度越高，患者的臨床情況越不良。盡管血清miRNA 表達(dá)水平的變化也可提示肝癌的發(fā)生，但檢測靈敏度遠(yuǎn)低于血清外泌體包含的miRNA[12]。另外，外泌體檢測可為評估肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移狀況提供幫助。肝癌患者血清外泌體miRNA-638 表達(dá)減少與腫瘤體積、血管浸潤程度、TNM 分期呈負(fù)相關(guān)[13]；血清外泌體miRNA-125 b 低水平表達(dá)的肝癌病人復(fù)發(fā)時(shí)間短，且人群總生存率較低[14]。

以上研究表明，外泌體具有成為診斷標(biāo)志物的潛能。不同外泌體miRNA 表達(dá)水平的變化有不同臨床的意義，部分可作為早期肝癌的診斷指標(biāo)并且一定程度上可提示肝癌的病理分期，部分可提示肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移情況，且其作為肝癌生物標(biāo)志物可為評估肝癌患者預(yù)后情況提供幫助。

3 外泌體與肝癌治療

目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療肝癌已有多種手段，其中以肝臟切除為治愈肝癌的主要手段，但其可行性受肝臟儲備功能、余肝體積、腫瘤病理和全身情況等因素影響；此外，肝癌細(xì)胞對部分化療藥物也出現(xiàn)了耐藥，故尋找新的肝癌治療方法、研究提高肝癌治療效果的方式顯得尤為重要。目前研究表明，外泌體具有成為藥物載體以及治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用潛能。

3.1 外泌體作為藥物載體 外泌體易于從體液中提取，且具有低免疫原性、高生物滲透性和天然的靶向能力，是天然的內(nèi)源性納米載體，作為藥物遞送載體有很大的優(yōu)勢，也已成為目前研究的熱點(diǎn)。LOU G等[15]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cell，AMSC）分泌的含miRNA-122 和miRNA-199外泌體可明顯增高HUh7 肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，此外將索拉非尼與含有miRNA-122 的脂肪AMSC 來源的外泌體腹腔注射于實(shí)驗(yàn)動物，發(fā)現(xiàn)索拉非尼療效明顯提高。何淑芳等[16]發(fā)現(xiàn)由外泌體遞送的CDK1-siRNA 在細(xì)胞水平及動物水平均可有效抑制CDK1 基因的表達(dá)，具有顯著的抗腫瘤效果，并且對正常的肝細(xì)胞和組織不具有毒性，可實(shí)現(xiàn)肝癌的安全高效治療。以上實(shí)驗(yàn)研究表明，外泌體是可以定向遞送內(nèi)容物的高效運(yùn)載體，促進(jìn)調(diào)控腫瘤靶基因，具有提高療效、減少副作用的潛在價(jià)值。周儉等[17]將外泌體作為藥物遞送載體的優(yōu)越性應(yīng)用于臨床，發(fā)明了一種肝癌治療性外泌體藥物，通過預(yù)先降低或消除外泌體中促進(jìn)肝癌進(jìn)展的活性成分，使肝癌細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體能夠在不具有促癌功能的同時(shí)保留與肝癌細(xì)胞的組織親和性，繼而攜載miR-26a 等miRNA 分子抑制肝癌進(jìn)展。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，抗腫瘤中藥的多組分協(xié)同作用優(yōu)于許多化療藥物，但其難溶性成分的不易吸收和無選擇性分布，使抗腫瘤中藥的治療效果未能全部發(fā)揮。目前研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可承載中藥，將有效成分遞送至靶細(xì)胞，提高中醫(yī)藥防治肝癌的效果。在中藥活性成分姜黃素能夠抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)[18]，以外泌體作為姜黃素的藥物載體，可明顯提高姜黃素在體內(nèi)的濃度、藥物穩(wěn)定性，且無明顯不良反應(yīng)。表明外泌體有望成為一種有效的、現(xiàn)代化的中藥制備工藝與給藥方式。

3.2 外泌體作為治療靶點(diǎn) 外泌體miRNA 通過不同的機(jī)制影響著肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，其中每一個(gè)過程都可以成為療法的靶點(diǎn)。外泌體所攜帶的miRNA-221 可影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p27kip1、p57kip2，在此基礎(chǔ)上，切斷運(yùn)載miRNA-221 的外泌體可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞出現(xiàn)G1 期阻滯，有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖活動，并阻止其克隆形成及遷移侵襲[19]。針對肝癌細(xì)胞源性外泌體可使巨噬細(xì)胞PDL1 的表達(dá)升高并介導(dǎo)免疫逃逸，Wu B 等[20]將未處理肝癌細(xì)胞源性外泌體和經(jīng)褪黑素處理的肝癌細(xì)胞來源外泌體對照進(jìn)行體內(nèi)、外研究，處理組巨噬細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)下降，且通過巨噬細(xì)胞STAT3 途徑改變免疫抑制狀態(tài)。以上研究表明以參與免疫抑制、肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的外泌體為靶點(diǎn)治療肝癌，具有良好的研究與臨床應(yīng)用潛能。

4 總結(jié)

外泌體在肝癌發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)中的作用以及應(yīng)用價(jià)值是近年來的研究熱點(diǎn)。目前，在學(xué)術(shù)理論上已經(jīng)廣泛認(rèn)可外泌體存在于人體體液中，其所攜帶的miRNA 可作為肝癌診斷和預(yù)后評估的新生物標(biāo)志物，并且其臨床意義可能優(yōu)于傳統(tǒng)肝癌生物標(biāo)志物。但外泌體所包含的miRNA 種類繁多且變化也不盡相同，如miRNA-665、miRNA-125b、miRNA-638 等數(shù)量的變化都可提示肝癌的發(fā)生，這意味著目前未明確以何種miRNA 為準(zhǔn)來診斷原發(fā)性肝癌，變化量標(biāo)準(zhǔn)也未知。

筆者認(rèn)為，局限于單一外泌體檢測試驗(yàn)而缺乏可靠的識別與肝癌病理學(xué)特征相關(guān)的外泌體檢測指標(biāo)體系限制了我國臨床上將外泌體應(yīng)用于肝癌早期診斷，為加快將外泌體診斷潛力轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)用效益、提高肝癌早期臨床診斷率，應(yīng)加強(qiáng)在建立外泌體檢測指標(biāo)體系方面的研究。

許多研究已證實(shí)外泌體是防治肝癌的潛在靶點(diǎn)，但迄今為止，外泌體參與肝癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制仍未完全明確，外泌體如何調(diào)節(jié)受體細(xì)胞與供體細(xì)胞的功能以及如何改造外泌體并應(yīng)用于臨床的研究仍較欠缺。外泌體作為藥物載體在中、西醫(yī)治療中都具有增強(qiáng)療效的作用，尤其是對于克服中藥難溶性成分的吸收有重要作用。筆者認(rèn)為，中藥復(fù)方可成為中醫(yī)藥防治肝癌與外泌體結(jié)合研究和利用之間的聯(lián)系，借助于外泌體作為藥物載體的優(yōu)勢，加強(qiáng)對具有抗肝癌作用的藥物、方劑的研究和利用，更好的發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢。