現(xiàn)代生物技術(shù)在藥用植物研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

梅 瑜，黃能旭，顧 艷，王繼華*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；2.康美（惠來(lái)）中藥材種植有限公司，廣東揭陽(yáng)515200）

生物技術(shù)是一門利用生物科學(xué)研究成果和工程手段來(lái)增加生物制品數(shù)量、提高質(zhì)量，從而滿足人類日益增長(zhǎng)需求的技術(shù)，具體內(nèi)容包括細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶和蛋白質(zhì)工程、基因工程等4 個(gè)方面[1]。

自20 世紀(jì)70 年代重組DNA 技術(shù)產(chǎn)生后，許多科學(xué)家致力于應(yīng)用生物技術(shù)改良生物體。隨著科技的發(fā)展，生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于園藝產(chǎn)業(yè)。我國(guó)園藝作物主要包括蔬菜、水果、花卉，以及特有的食用菌、茶葉、中藥材和西甜瓜等[2]。生物技術(shù)使中國(guó)園藝產(chǎn)業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，尤其在中國(guó)藥用植物研究和中藥現(xiàn)代化發(fā)展方面，提供了重要機(jī)遇，如目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)金線蓮[3]、石斛[4]、崗梅[5]、穿心蓮[6]等珍稀藥用植物的組培快繁。通過(guò)此技術(shù)可對(duì)中草藥的活性成分、生長(zhǎng)規(guī)律、生產(chǎn)特征等進(jìn)行研究，也可運(yùn)用生物工程技術(shù)對(duì)中草藥資源進(jìn)行保存，為瀕危中藥材資源保護(hù)創(chuàng)造了有利條件。

我國(guó)中藥資源豐富，應(yīng)用歷史悠久，是我國(guó)傳統(tǒng)藥學(xué)寶庫(kù)，也是我國(guó)中醫(yī)學(xué)防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥在醫(yī)療保健中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[7]?，F(xiàn)代生物技術(shù)能夠從分子水平闡述中藥及其復(fù)方的作用機(jī)理，保護(hù)中藥的種質(zhì)資源與基因資源，研發(fā)中藥新藥以及進(jìn)行中藥材的現(xiàn)代鑒定等。可以根據(jù)不同品種的生產(chǎn)要求，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制和在線監(jiān)測(cè)，利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)、膜技術(shù)、大孔樹脂吸附、納米科技等高新技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥品質(zhì)量的穩(wěn)定和可控。另外，還可應(yīng)用蛋白質(zhì)重組等高通量技術(shù)研究其作用的分子機(jī)制，從蛋白質(zhì)圖譜的變化中尋找中藥靶點(diǎn)和途徑，以利于新藥研發(fā)和中藥的二次開發(fā)[8]。

1 組織培養(yǎng)技術(shù)

由于野生藥材資源日益枯竭，而人工栽培品種品質(zhì)不穩(wěn)定，組織培養(yǎng)技術(shù)成為現(xiàn)代最先進(jìn)的植物繁殖技術(shù)，利用植物細(xì)胞再生能力，培育出完整植株，具有低成本、高效率、生產(chǎn)周期短、無(wú)性遺傳特性一致的優(yōu)點(diǎn)。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行藥用植株無(wú)性繁殖，能夠解決藥用植物天然資源不足的問(wèn)題，特別是某些種子繁殖慢、繁殖難度高的藥用植物。Statish 等研究了中國(guó)臺(tái)灣的藥用植物和持續(xù)利用，成功進(jìn)行了某些藥用植物的組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)技術(shù)已成功運(yùn)用于石斛、桔梗、丹參、地黃、絞股藍(lán)、半夏、杜仲、懷山藥、麻黃、銀杏、肉蓯蓉、黃芪、紅景天、西洋參、雪蓮、五味子、何首烏、金線蓮等上百種藥用植物。

傳統(tǒng)的育種方法由于育種周期長(zhǎng)、見效慢的缺點(diǎn)，極大限制了藥用植物新品種的選育，因此組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)藥用植物新品種的選育和種質(zhì)資源的保存起到重要的作用。單倍體誘變到多倍體育種是培育藥用植物新品種的一種有效手段，李涵等[9]將野生的齒瓣石斛果實(shí)，在種子無(wú)菌萌發(fā)和組培快繁的基礎(chǔ)上，用倍性育種技術(shù)在短期內(nèi)培育出多倍體植株。李健等[10]利用組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合化學(xué)誘變、幼胚培養(yǎng)等育種手段，選育出了三倍體無(wú)籽枸杞（99-3）新品系。

2 色譜技術(shù)

氣相色譜技術(shù)能利用物質(zhì)在流動(dòng)相與固定相中的分配系數(shù)差異而分離提取中藥中的有效成分，但此技術(shù)難度較大，導(dǎo)致療效差、質(zhì)量不可控。20 世紀(jì)70 年代高效液相色譜法崛起，彌補(bǔ)了氣相色譜法不能直接用于分析、難揮發(fā)、不穩(wěn)定及高分子樣品的弱點(diǎn)，擴(kuò)大了色譜法的應(yīng)用范圍[11]。20 世紀(jì)80 年代，末毛細(xì)管電泳法較好地彌補(bǔ)了高效液相色譜效率低、擴(kuò)散系數(shù)小等不足[12]，分離效果（柱效可達(dá)到107）遠(yuǎn)大于經(jīng)典的色譜法。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，產(chǎn)生了超臨界流體萃取-高效液相色譜（SFE-HPLC）聯(lián)用技術(shù)，此技術(shù)選擇性強(qiáng)、靈敏度高，多用于自動(dòng)化萃取芳香族化合物。近幾年，許多學(xué)者將LC-NMR/MS 聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用到內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的鑒定，鑒定復(fù)雜天然代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、臨床藥物在體內(nèi)外代謝物的結(jié)構(gòu)等[13]。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)給生命科學(xué)帶來(lái)飛躍式的發(fā)展，主要方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、種質(zhì)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移和外源基因直接導(dǎo)入法。國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因成功的作物有35 科120 多種，包括木瓜、棉花、玉米、大豆、馬鈴薯等[14]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)了園藝作物的抗逆性，提升了其產(chǎn)量和品質(zhì)。藥用植物基因工程雖然起步較晚，但也有一些可喜成果，其主要目的是將該基因過(guò)表達(dá)來(lái)獲得天然活性成分，目前轉(zhuǎn)基因的藥用植物有8 種。常用的導(dǎo)入基因的載體是煙草和玉米，如在煙草中轉(zhuǎn)入目的基因可以生產(chǎn)人用溶酶體酶及多種人與動(dòng)物疾病抗體，轉(zhuǎn)入目的基因的玉米會(huì)生產(chǎn)重組霍亂疫苗、單克隆抗體等。戴均貴等[15]用長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了對(duì)天麻素的生物轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在優(yōu)化種質(zhì)、保護(hù)和繁殖珍稀瀕危動(dòng)植物品種、保證中藥資源可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用。但現(xiàn)階段人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物褒貶不一，因此大規(guī)模生產(chǎn)難以實(shí)現(xiàn)。目前基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)在水稻、小麥、番茄、香蕉、馬鈴薯的品質(zhì)改善和增產(chǎn)等方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用。此技術(shù)不引入“外源”基因，僅對(duì)“自身”的基因進(jìn)行敲出、特異突變引入等，不存在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

4 離子束生物技術(shù)

離子束生物工程是由中科院等離子體物理研究所的余增亮等人[16]在1986 年首先發(fā)現(xiàn)的，作為作物誘變育種新的誘變?cè)?，具有巨大的?yīng)用價(jià)值，對(duì)生物體具有重要的誘變效應(yīng)，主要包括物理效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)和生物效應(yīng)[17]。離子束注入生物體時(shí)會(huì)發(fā)生分子水平上的物理效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)，造成的損傷是微觀損傷，之后不可逆生物過(guò)程被放大，就產(chǎn)生了生物突變效應(yīng)，從而產(chǎn)生了新的種質(zhì)資源。有學(xué)者將低能離子束注入番茄種子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注入離子束后番茄的品質(zhì)顯著提高[18]。另有學(xué)者將低能N+注入水稻，發(fā)現(xiàn)提高了脫落酸合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而增加了內(nèi)源脫落酸的含量[19]。還有學(xué)者利用N+注入技術(shù)來(lái)誘變桑黃菌株，結(jié)果獲得了多糖含量高且遺傳性狀穩(wěn)定的菌株[20]。

離子束的誘變率較傳統(tǒng)誘變效率高，可借助離子束生物工程，結(jié)合生物工程、基因工程、植物細(xì)胞工程，對(duì)藥用植物合理利用和開發(fā)，使藥用植物研究、藥學(xué)研究和新藥開發(fā)的技術(shù)手段得到改善和更新。

5 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)

DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的建立是植物資源學(xué)研究方法的重大突破，在植物種質(zhì)資源鑒定方面起到了重要作用，尤其為藥用植物種質(zhì)資源的分類與鑒定開辟了新的途徑。藥用植物種質(zhì)資源的鑒定是藥用植物研究的基礎(chǔ)，對(duì)準(zhǔn)確確定原植物、確保藥效、合理保存利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源等具有重要意義[21]。分子生物學(xué)可以將生物性狀從表征擴(kuò)展到生物信息大分子，利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)反映遺傳密碼傳遞順序，可以進(jìn)行分子水平上的中藥質(zhì)量控制，也是中草藥道地性最有價(jià)值的分類鑒定指標(biāo)。

有學(xué)者利用RAPD 標(biāo)記法對(duì)甘肅省不同產(chǎn)地的18 個(gè)當(dāng)歸樣本進(jìn)行了分析，獲得了10 個(gè)多肽引物，并對(duì)遺傳距離進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示地理分布的遠(yuǎn)近決定遺傳背景差異的大小，說(shuō)明生態(tài)環(huán)境對(duì)當(dāng)歸遺傳差異的影響不可忽視，也為從分子生物學(xué)方面研究當(dāng)歸道地性奠定了基礎(chǔ)[22]。目前RAPD 技術(shù)已成功用于天麻[23]、絞股藍(lán)[24]、柴胡[25]、龍膽草[26]、西洋參[27]、溪黃草[28]的親緣關(guān)系及遺傳多樣性的鑒定。

6 指紋圖譜技術(shù)

中藥指紋圖譜利用由Williams 和Welsh[29-30]研究小組發(fā)展起來(lái)的RAPD 技術(shù)、Vos 等的AFLP[31]、PCR-RFLP、DNA 探針雜交、小衛(wèi)星SSR[32]、微衛(wèi)星（ISSR）[33]指紋分析等技術(shù)手段，得到能夠顯現(xiàn)中藥材或中成藥性質(zhì)的圖像、圖形、光譜的圖譜及其數(shù)據(jù)。指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)是控制中藥質(zhì)量的先進(jìn)技術(shù)，促進(jìn)了中藥生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，是帶動(dòng)中藥工業(yè)現(xiàn)代化的關(guān)鍵技術(shù)，使中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展從以數(shù)量為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐再|(zhì)量為主。

7 小結(jié)

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用日益深入廣泛，不僅對(duì)園藝產(chǎn)業(yè)造成影響，也對(duì)環(huán)境、醫(yī)學(xué)等其他行業(yè)影響深遠(yuǎn)，如現(xiàn)代生物技術(shù)給傳統(tǒng)工業(yè)帶來(lái)了全新的思路，生產(chǎn)環(huán)境不再需要高溫、高壓，而是由模擬生命過(guò)程的生物反應(yīng)器代替。此外，利用生物技術(shù)可以改良傳統(tǒng)工藝，把農(nóng)副原料加工成發(fā)酵或釀造制品，還可以進(jìn)行食品添加劑和酶制劑的研制與開發(fā)，豐富了人們的生活，提高了生活質(zhì)量。