張樹山，韓雪峻，姜紅菊，張德福*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 2013021）

近五年來，在豬精液冷凍保存技術(shù)飛速發(fā)展、國家政策及非洲豬瘟等幾大因素合力推動下，依托大、中型種豬生產(chǎn)企業(yè)的冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)平臺、銷售及技術(shù)支持等完整產(chǎn)業(yè)鏈已初具規(guī)模，市場發(fā)展前景廣闊。豬冷凍精液（簡稱“凍精”）能突破時空限制，使種豬生產(chǎn)企業(yè)能快捷地為客戶提供優(yōu)質(zhì)凍精和售后技術(shù)支持，在提高引種效率和豬場生物安全性等方面意義尤為重大。眾所周知，豬凍精的品質(zhì)主要受精子耐凍性、冷凍稀釋液以及凍精制作過程（包括精液采集、稀釋、降溫平衡、冷凍和解凍等）操作等因素影響，其品質(zhì)是眾多因素的合力的結(jié)果。文章就豬凍精制作涉及影響因素作一梳理，目的在于拋磚引玉、為從事豬精液冷凍保存技術(shù)研究及凍精商業(yè)化生產(chǎn)的同行提供一些參考。

1 公豬精液采集環(huán)節(jié)

1.1 公豬精子耐凍性

與其他畜種的精子相比，豬精子耐凍性的個體差異性更為顯著。一個公豬站在規(guī)模化生產(chǎn)凍精前，一般要對所有公豬的精液進(jìn)行冷凍試驗（即精子耐凍性篩選），解凍后精子活力、頂體完整性和畸形率等指標(biāo)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的公豬可用于凍精生產(chǎn)。具有高育種價值的種公豬可降低篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 公豬采集精液品質(zhì)

采精場地應(yīng)該注意衛(wèi)生、消毒，有條件的公豬站也可采用自動采精系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的采精方式，通過自動采精系統(tǒng)可以大幅度地降低精液中細(xì)菌含量。采精人員要嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，只收集射精中第2段富含精子的乳白色精液。豬精液品質(zhì)受季節(jié)、年齡和個體健康等因素影響，而原精品質(zhì)是直接影響凍精制作成功與否的決定性因素之一。故技術(shù)人員必需重視原精的精液品質(zhì)指標(biāo)檢測，還要注意觀察精液顏色、氣味、膠狀物等是否正常，并作好記錄。對有炎癥以及老齡的公豬應(yīng)該及時治療或淘汰。

1.3 精液采集與預(yù)稀釋

豬精液采集后應(yīng)盡快檢測原精液的密度和活力，并以預(yù)稀釋液等溫做1∶1稀釋。在不同公豬站，原精送抵實驗室的實時溫度由運送時間和保溫裝置決定。在條件穩(wěn)定的情況下，技術(shù)人員應(yīng)通過多次測定精液運抵實驗室的溫度，參照該溫度來設(shè)置水浴溫度，從而能提前備好等溫預(yù)稀釋液，該溫度可能隨季節(jié)有所變化。

1.4 精子的預(yù)篩選

死亡精子會釋放出H2O2，死亡精子數(shù)量的增多可加劇活精子遭受的氧化損傷程度，發(fā)生凋亡的精子受精能力也會大大降低甚至喪失。除把控好精液品質(zhì)檢測外，將精液中死亡或發(fā)生凋亡的精子去掉，對提高豬精液冷凍效果尤為重要。盡管關(guān)于精子篩選的相關(guān)研究起步較早，但大多方法要么適用于體外受精操作前的小體積精液處理，要么成本較高，如梯度離心法（如Pecoll法）和免疫磁珠法等。近幾年瑞典研究人員研發(fā)出一種單層離心方法（Single Layer Centrifugation，SLC），被認(rèn)為是一種適用大體積精液且效果較好的一種高品質(zhì)精子篩選方法。然而，尚未查到該產(chǎn)品的具體上市信息。

2 降溫平衡環(huán)節(jié)

2.1 降溫平衡條件

精液采集、運抵實驗室后，豬精液的降溫平衡包括的室溫、17 ℃和4 ℃ 3個階段。與其他家畜精子相比，豬精子對外界溫度變化更為敏感，溫度的快速下降、波動和17 ℃平衡階段溫度低于15 ℃，都會對豬精子產(chǎn)生不利影響和“低溫打擊”。室溫階段：豬精液采集后立即送往實驗室，一般將精液瓶/袋用毛巾作簡單包裹、室溫下靜置1 h左右；17℃階段：該階段降溫平衡被認(rèn)為能增加豬精子的抗“低溫打擊”能力。除采用多層紗布或棉絮包裹外，也有采用水浴降溫，即將精液瓶/袋沒入與精液等溫的水中，通過加冰塊或逐步減少水量來提高降溫速度。水浴箱要放置溫度計并注意能實時觀察降溫情況（箱內(nèi)水量越大降溫速率越小），注意盡量排出精液瓶/袋中的空氣并密封好，尤其注意精液溫度不能低于15 ℃以下。4 ℃階段降溫平衡方法同17 ℃階段。目前，已有可精確控制降溫速率的降溫平衡柜（如北京田園奧瑞生產(chǎn)的“程序控溫平衡儀”）問世，將精液瓶/袋移至柜中，就能以一定的降溫速率從精液溫度平緩降溫至目的溫度，操作方便、尤其適用于凍精的規(guī)模化生產(chǎn)。

2.2 離心濃縮及兩次稀釋操作

17 ℃降溫平衡結(jié)束后，即進(jìn)行離心濃縮、等溫添加含有雞蛋卵黃的冷凍稀釋液（Ⅰ液）。豬精液具有體積大、精子密度小的特點，必需通過離心（800× g，10 ～ 25 min，17 ℃）才能實現(xiàn)冷凍保存。但離心操作會導(dǎo)致部分精子因位于沉淀下部、緊貼離心瓶底而產(chǎn)生損傷。有人采用在離心時在離心瓶底部加入1～2 mL市售液體試劑（也稱“緩沖墊”）的方法，可避免精子沉淀黏附在離心瓶底、減輕離心對精子的損傷程度，并能延長精液的離心時間、能有效避免離心后部分活力較好精子上浮至上清液，從而造成的精子損失。

4 ℃降溫平衡后，等溫添加含有冷凍保護(hù)劑的冷凍稀釋液（Ⅱ液）。

冷凍稀釋液Ⅰ、Ⅱ液應(yīng)分別與降溫平衡的精液置于同一處，確保等溫稀釋。稀釋前，應(yīng)分別將精液和冷凍稀釋液上下顛倒、充分混勻；加入冷凍稀釋液體積較大時，應(yīng)分步稀釋（即先加入部分稀釋液混勻后再加入剩余部分、混勻）。

2.3 冷凍稀釋液因素

在整個降溫平衡和冷凍-解凍過程中，冷凍稀釋液的因素不容忽略。其功能是為精子提供一個適宜的pH與滲透壓和較低細(xì)菌數(shù)量的環(huán)境，且能為精子提供能量、增強(qiáng)其抗冷休克和抗冷凍損傷能力。

配制冷凍稀釋液應(yīng)注意：1）配制和分裝稀釋液的用具必須刷洗干凈并進(jìn)行嚴(yán)格消毒。2）試劑應(yīng)該選擇分析純或化學(xué)純，根據(jù)配方精確稱量，配制稀釋液最好使用pH 7.0左右的蒸餾水。3）卵黃要取自新鮮雞蛋，不能混入蛋清或卵黃膜等雜物。4）配制好溶液后應(yīng)檢測pH和滲透壓（如有條件）并調(diào)節(jié)至配方要求值。配制好溶液的pH偏差太大，說明溶液配制極有可能出現(xiàn)了失誤，應(yīng)重新配制。5）預(yù)稀釋液、基礎(chǔ)稀釋液和解凍液等溶液配制好后要進(jìn)行過濾（0.25 μm）或高壓滅菌?？股亍⒙腰S和酶類等成分，應(yīng)在溶液消毒冷卻后添加，或臨使用前添加并充分?jǐn)嚢琛?）溶液配制好后應(yīng)該密封并冷藏保存，1周內(nèi)使用。

市售豬凍精稀釋粉套裝則對操作人員要求相對較低、使用方便，但成本高一些。配制冷凍稀釋液時要嚴(yán)格根據(jù)說明書的提示進(jìn)行。

3 冷凍降溫環(huán)節(jié)

3.1 精液灌裝、封口和裝架

添加冷凍稀釋液Ⅱ液后，即在低溫條件（4℃）進(jìn)行灌裝、封口和裝架等操作。在操作過程中，程控低溫柜（成本高）或改造冰柜（結(jié)合控溫器，成本較低）可能溫度會上升，可采用放置冰塊或盛有液氮的泡沫盒，并通過觀察程控低溫柜（改造冰柜）不同位置溫度計及時調(diào)節(jié)溫度。

3.2 冷凍降溫操作

提前將程控冷凍儀打開，執(zhí)行程序。將冷凍料架標(biāo)記并碼好，快速將其移至程控冷凍儀中，蓋好即開始冷凍降溫。程控冷凍儀應(yīng)與程控低溫柜（或改造冰柜）相鄰，盡量減少冷凍料架移動距離，二者位置或高度等應(yīng)根據(jù)技術(shù)人員喜好作調(diào)整。技術(shù)人員應(yīng)該佩帶護(hù)目鏡、手套、防護(hù)圍裙和套袖。冷凍降溫結(jié)束后，依照冷凍料架標(biāo)記，并將冷凍細(xì)管快速分別移至倒有液氮的泡沫盒中。啟動精子程序冷凍儀加熱程序，用于去除箱體中水蒸汽。

冷凍細(xì)管收集操作過程中，應(yīng)注意冷凍細(xì)管和布袋均保持在液氮面以下操作。

3.3 設(shè)備的維護(hù)

與牛、羊等家畜相比，盡管使用離心濃縮方法，裝管前，一般每頭份豬精液仍可達(dá)幾十毫升，多的可達(dá)100 mL以上。以0.5 mL細(xì)管為例，多頭份精液的灌裝、封口和打印等采用人工操作其勞動量極大，故加強(qiáng)相關(guān)設(shè)備定期保養(yǎng)、保持其正常運行對凍精的規(guī)模化生產(chǎn)非常重要。如：進(jìn)行精液灌裝、封口操作時，要注意儀器聲音是否異常、打印機(jī)墨水余量（實驗室要有備貨以便及時添加）；低溫操作柜在使用結(jié)束后，可以在其中放置電風(fēng)扇減少灌裝、封口和打印儀器內(nèi)外水蒸汽，最后將小型移動式紫外燈置于低溫操作柜內(nèi)定時消毒。冷凍儀在冷凍降溫程序結(jié)束后，要及時開啟加熱程序來減少其冷凍箱體內(nèi)水分；此外，尤其在南方炎熱地區(qū)，當(dāng)冷凍儀與液氮罐之間連接管斷開后，一些昆蟲類（如蟑螂）可能會通過連接管的開口端進(jìn)入到程控冷凍儀中，甚至能到達(dá)液氮噴嘴部位，可能會降低液氮噴速或堵塞。故當(dāng)冷凍儀與液氮罐之間連接管斷開后，應(yīng)對連接管的開口端作密封處理。

4 技術(shù)人員因素

毛主席在《論持久戰(zhàn)》中指出，決定勝負(fù)的因素是人不是物。在影響凍精品質(zhì)的眾多因素中，技術(shù)人員是凍精制作的最重要影響因素之一，幾乎能影響到凍精制作的所有環(huán)節(jié)。 第一，要求技術(shù)人員有“干一行、愛一行、專一行”的工作態(tài)度和敬業(yè)精神，尤其要有忍耐寂寞的能力，才能在較封閉的種公豬站內(nèi)能保持不急不燥的工作態(tài)度。第二，凍精制作過程中，溶液配制、稀釋操作和降溫平衡等操作均需要規(guī)范的操作技能和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。故要加強(qiáng)對技術(shù)人員的培訓(xùn)、樹立生物安全意識和認(rèn)真的工作態(tài)度，善于學(xué)習(xí)并能從工作中發(fā)現(xiàn)并解決問題。第三，凍精整個制作流程至少需要2～3人默契配合，出現(xiàn)問題需要團(tuán)隊成員能各抒己見地提出自己觀點、形成解決方案并執(zhí)行。這就要求團(tuán)隊負(fù)責(zé)人能通過團(tuán)隊共同的、切實可行的愿景、制定完善的規(guī)章制度及營造相互信任的組織氛圍等手段來建立一個高效、團(tuán)結(jié)的團(tuán)隊，與團(tuán)隊每一位成員的努力是分不開的。

5 小結(jié)

豬凍精的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用已開始步入快車道，商品化凍精在優(yōu)秀種公豬遺傳資源突破時空限制、提高生物安全性等方面已顯現(xiàn)出革命性推動養(yǎng)豬業(yè)飛速發(fā)展的先兆。當(dāng)前，擺在凍精商業(yè)化生產(chǎn)者面前一個重要問題就是，如何利用現(xiàn)有成熟的豬凍精生產(chǎn)技術(shù)，依托日趨高效、完善的設(shè)備生產(chǎn)出高品質(zhì)的凍精。依據(jù)“木桶效應(yīng)”原理，整個凍精制作流程中每一個環(huán)節(jié)或影響因素都是“木桶”（即凍精品質(zhì)）的一塊木板，其重要性都不容小覷。故凍精生產(chǎn)管理者和技術(shù)人員應(yīng)逐步理順決定凍精品質(zhì)的環(huán)節(jié)和因素，以系統(tǒng)工程理論指導(dǎo)，注重細(xì)節(jié)、從小處著手規(guī)范操作和針對影響因素對凍精制作流程逐步完善，通過積量變?yōu)橘|(zhì)變提高豬凍精品質(zhì)以及推動豬凍精技術(shù)更上一層樓！

參考文獻(xiàn)（略）