產(chǎn)前B超、MRI及高通量測(cè)序在先天性腎缺如中的應(yīng)用

鐘 強(qiáng)，錢 雯，張競(jìng)之，林曉靜，潘 衛(wèi)，周遵倫

1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2貴州省產(chǎn)前診斷中心，4婦產(chǎn)科，貴州貴陽(yáng) 550000；3貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000

腎缺如（RA）是胎兒腎臟在胚胎發(fā)育過(guò)程中輸尿管芽形成失敗或者到達(dá)/誘導(dǎo)后腎間充質(zhì)機(jī)制發(fā)生障礙，以至于胎兒腎臟形成失敗，包括單側(cè)腎缺如（URA）與雙側(cè)腎缺如（BRA）[1]。其中，BRA是一種極端的出生缺陷，與生命不相容，新生兒發(fā)病率為萬(wàn)分之一至萬(wàn)分之三，其胎兒具有典型的面部特征：突出的內(nèi)眥贅皮，鼻尖鈍或向下彎曲的扁平鼻子，下唇和下巴尖端之間的凹陷異常突出等“波特相”及其他面部異常；而URA的新生兒發(fā)病率約為1‰，明顯高于BRA，雖能與生命相容，但對(duì)其生存質(zhì)量有一定影響，如蛋白尿、高血壓和早期腎功能衰竭等，是新生兒或兒童終末期腎病的重要原因之一[2]。在臨床上，我們發(fā)現(xiàn)URA患者往往因孤立腎代償性肥大，從而能夠維持人體正常的水和電解質(zhì)平衡，保持生理狀態(tài)，以至于在胎兒出生后直至長(zhǎng)大成人，大部分通常無(wú)明顯臨床癥狀，甚至終身不被發(fā)現(xiàn)[3]。為了在孕期能更好的對(duì)胎兒RA進(jìn)行產(chǎn)前診斷或并進(jìn)行必要的干預(yù)，使孕婦及胎兒有良好的預(yù)后，探討和尋找更多安全經(jīng)濟(jì)的診斷技術(shù)已成為了必要條件。

1 胚胎腎臟的正常發(fā)育

人類腎臟發(fā)育始于妊娠早期，腎臟的發(fā)育分為前腎、中腎和后腎3個(gè)不同但重疊的階段，前腎和中腎是短暫的排泄系統(tǒng)，最終在不影響永久性腎系統(tǒng)的情況下消失，后腎在胚胎發(fā)育的第5周開始，并最終發(fā)育為成熟的功能腎[4]。輸尿管芽在妊娠第5周侵入周圍的后腎間質(zhì)，發(fā)生分支，建立腎臟的放射狀結(jié)構(gòu)和腎單位數(shù)。來(lái)自輸尿管芽分支尖端的信號(hào)誘導(dǎo)腎單位的形成，并將后腎間質(zhì)轉(zhuǎn)化為腎上皮（腎小泡）；相反，后腎間質(zhì)可釋放信號(hào)刺激輸尿管芽分支。腎小泡最終形成腎小球、近端小管和遠(yuǎn)端小管。妊娠9～10周時(shí)第1個(gè)腎小球形成[5]。在妊娠12～14周，后腎和輸尿管芽分支的早期穿透以形成腎盂，后腎開始功能化，并在妊娠第20周時(shí)，輸尿管芽分枝成15代并形成整個(gè)集合管系統(tǒng)，完成胚胎腎臟發(fā)育的30%[1]。直至第34～36周腎單位發(fā)育完成，形成最終的成熟腎臟[6]。上皮結(jié)構(gòu)輸尿管芽侵襲后腎間充質(zhì)組織相互誘導(dǎo)相互作用是胚胎腎臟正常發(fā)育的關(guān)鍵階段[7]。

2 產(chǎn)前B超

產(chǎn)前B超利用高頻聲音脈沖產(chǎn)生圖像[8]，是產(chǎn)前診斷胎兒結(jié)構(gòu)異常的主要影像學(xué)技術(shù)。在妊娠中期進(jìn)行B超掃描能檢測(cè)到大多數(shù)的腎臟結(jié)構(gòu)異常，最早在妊娠9周時(shí)就可以看到胎兒腎臟是否發(fā)育正常[9]。在妊娠9～12周，胎兒正常發(fā)育腎臟呈小葉狀，可以在產(chǎn)前超聲影像中椎旁區(qū)域發(fā)現(xiàn)；15～20周間發(fā)生皮質(zhì)髓質(zhì)分化，到20周時(shí)，具有低回聲，髓質(zhì)暗腎錐體的回聲皮質(zhì)應(yīng)明顯[5]。若胎兒腎臟發(fā)育異常，產(chǎn)前B超可以較為準(zhǔn)確的進(jìn)行識(shí)別[10]。產(chǎn)前超聲技術(shù)的改進(jìn)，正使其逐漸成為出生缺陷產(chǎn)前診斷的常規(guī)程序，在一項(xiàng)對(duì)298例兒童進(jìn)行了通過(guò)產(chǎn)前B超的選擇性畸形診斷中，95例（30.3%）在產(chǎn)前被診斷?；螜z出率為：中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常（68.6%）、胃腸道異常（42.3%）、泌尿系統(tǒng)異常（24.1%）、心臟異常（5.9%）[11]。另一項(xiàng)通過(guò)相關(guān)產(chǎn)前診斷技術(shù)對(duì)先天性腎和尿路畸形的流行病學(xué)研究中，RA在所有畸形胎兒中的診斷率高達(dá)18.96%（529/2790）[12]。目前，RA的診斷沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但通過(guò)B超影像學(xué)中的一些表現(xiàn)，結(jié)合臨床信息，可以幫助診斷胎兒是否為RA。在妊娠16周后，產(chǎn)前B超提示胎兒腎窩中沒有腎臟、膀胱空虛以及羊水過(guò)少則是診斷BRA的有力指標(biāo)，并且因?yàn)槟I動(dòng)脈在后冠狀位應(yīng)視為腹主動(dòng)脈的直接分支，略低于腸系膜動(dòng)脈的起點(diǎn)，所以B超下腎動(dòng)脈的缺失也高度提示BRA[9]。伴隨著超聲技術(shù)的飛速發(fā)展，胎兒RA診斷的準(zhǔn)確性越來(lái)越高。Bronshtein等[13]在妊娠14～18周通過(guò)對(duì)21例包括有URA等輕微腎臟異常的胎兒經(jīng)陰道超聲檢查確診了9例（43%）URA，并在胎兒出生后或者尸檢檢查時(shí)確診。另有學(xué)者認(rèn)為在第16周和第20周之間對(duì)每位孕婦進(jìn)行常規(guī)超聲檢查可以避免漏診或誤診BRA[14]。產(chǎn)前超聲技術(shù)對(duì)于胎兒RA的診斷價(jià)值顯而易見，相對(duì)安全且經(jīng)濟(jì)，容易讓孕婦及家屬接受，建議妊娠孕婦在妊娠中晚期定期行超聲檢測(cè)胎兒是否有RA。但是產(chǎn)前B超也有其局限性：首先，胎兒腎臟在通過(guò)B超成像的質(zhì)量不僅取決于超聲設(shè)備的技術(shù)能力，還取決于操作員的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識(shí)；再者，在妊娠早期，對(duì)于單純的URA和其它輕微腎臟異常的胎兒，不容易被識(shí)別，而且在妊娠后期胎兒腎臟由妊娠早期的高回聲變成低回聲，擴(kuò)大的腎上腺等因素也會(huì)影響B(tài)超判斷，所以增加對(duì)診斷RA的難度，導(dǎo)致RA胎兒的診斷時(shí)間較晚：BRA的平均診斷時(shí)間為妊娠24周[11]，URA產(chǎn)前診斷的平均時(shí)間為26.5周[15]，甚至可能會(huì)造成RA誤診或漏診率較高。

3 產(chǎn)前MRI

早在1983年MRI就已經(jīng)在產(chǎn)前作為檢查工具[16]。同時(shí)，相對(duì)于B超在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，MRI有助于確認(rèn)超聲檢出的異常，更清晰地明確復(fù)雜畸形檢出、收集系統(tǒng)和血管解剖的顯示[17]。有學(xué)者對(duì)妊娠35周產(chǎn)前B超顯示左腎缺如的胎兒進(jìn)行MRI檢查，證實(shí)了雙側(cè)腎臟的存在[18]。Sohn等[19]通過(guò)對(duì)56例超聲提示胎兒先天異常進(jìn)行MRI檢查，發(fā)現(xiàn)有6例胎兒的診斷不一致，并且其中3例胎兒經(jīng)MRI檢查的結(jié)果和產(chǎn)后的診斷相同，提示產(chǎn)前超聲診斷錯(cuò)誤，表明MRI可以為胎兒解剖結(jié)構(gòu)提供了更準(zhǔn)確的影像學(xué)檢查。在產(chǎn)前超聲檢查結(jié)果不明確的情況下，胎兒MRI可作為補(bǔ)充手段，修正B超診斷，明確區(qū)分胎兒腎臟與鄰居組織器官是否存在或畸形的情況[20]。有學(xué)者對(duì)妊娠26周的胎兒行產(chǎn)前B超時(shí)因羊水過(guò)少，未能清晰顯示腎臟，無(wú)法明確診斷胎兒是否存在BRA，但通過(guò)胎兒MRI確認(rèn)了可以診斷，在妊娠第34周后胎兒自然分娩，并在1 h后死亡，尸檢證實(shí)BRA診斷[21]。另有一項(xiàng)回顧性分析文獻(xiàn)報(bào)道MRI對(duì)胎兒腎臟異常的診斷準(zhǔn)確率為94%(63/67)，充分表明MRI對(duì)胎兒RA的確診具有重要價(jià)值[22]。因此，疑似存在包括RA等腎臟異常的胎兒是在產(chǎn)科建議使用MRI檢查的唯二個(gè)已批準(zhǔn)和確定的指標(biāo)之一[23]。另一方面，關(guān)于MRI對(duì)孕婦及胎兒的影響，至今沒有足夠的證據(jù)表明產(chǎn)前MRI檢查對(duì)發(fā)育中的胎兒有任何有害報(bào)道；相反，研究表明在妊娠中期和晚期對(duì)胎兒進(jìn)行MRI成像在3.0T或更低的范圍內(nèi)是安全的[24]。但MRI造影劑容易經(jīng)胎盤屏障進(jìn)入胎兒循環(huán)系統(tǒng)，并通過(guò)胎兒腎臟過(guò)濾后排泄到羊水中可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)育異常，故不常規(guī)提供給孕婦[25]。因此在某種程度上，MRI成像水平受到一定的影響，診斷的精確度在某些情況下有所下降，但是產(chǎn)前MRI能協(xié)助超聲檢查更好的了解胎兒腎臟的病理解剖和定位，達(dá)到提高并改善孕婦及家屬的咨詢和妊娠管理[26]。而由于胎兒宮內(nèi)體位的改變可能也會(huì)導(dǎo)致MRI成像困難；另外，MRI的成本較高，因此MRI是否應(yīng)該成為胎兒RA產(chǎn)前診斷的常規(guī)輔助檢查還需要進(jìn)一步的大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析研究。

4 高通量測(cè)序技術(shù)（拷貝數(shù)變異測(cè)序和全外顯子測(cè)序）

大量研究表明，胎兒RA的病因主要是由遺傳因素導(dǎo)致的[27-29]。GDNF-Ret/GFRa1信號(hào)通路已被證實(shí)在調(diào)節(jié)胚胎輸尿管芽發(fā)育中至關(guān)重要，它們的缺失或突變將會(huì)導(dǎo)致RA[30]。但是它們之間的作用機(jī)制尚不清楚。而隨著高通量測(cè)序技術(shù)又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)[31]的問(wèn)世以來(lái)，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。RA的診斷和發(fā)病機(jī)制研究的瓶頸逐漸被打破。

腎臟發(fā)育異常50%左右的病因?yàn)槿旧w異常、拷貝數(shù)變異（CNV）和單基因遺傳病等[5]。CNV作為目前最常見的導(dǎo)致胎兒和兒童出生缺陷的原因，在有結(jié)構(gòu)缺陷的胎兒中，致病性或可能致病性CNVs的患病率為5.5%～10.5%[32]。Cai等[33]通過(guò)單核苷酸多態(tài)性陣列分析研究表明致病性CNV與腎臟發(fā)育有關(guān)，并在進(jìn)一步的研究中發(fā)現(xiàn)RA胎兒中致病性CNV發(fā)生率較高[34]。Uchiyama等[35]研究表明CNV位點(diǎn)KIF26B可調(diào)節(jié)胚胎腎臟輸尿管芽發(fā)育，KIF26B的缺失會(huì)導(dǎo)致RA。而CNV-seq作為“新一代”測(cè)序技術(shù)，運(yùn)用于胎兒產(chǎn)前診斷，提高了診斷的可靠性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，其廣泛應(yīng)用將使致病性或可能致病性拷貝數(shù)變異的檢出率提高1%[36]。Nagano等[37]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)在遺傳性腎臟疾病的病例中分析檢測(cè)到的致病性CNV會(huì)使EYA1基因缺失，EYA1已被鑒定為GDNF表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[30]，并且在小鼠中EYA1純合子缺失將會(huì)導(dǎo)致腎臟的缺乏[38]。

外顯子是人類基因組的蛋白編碼區(qū)域，雖然僅占全基因組1%左右[39]，卻與人類85%的疾病突變有關(guān)[40]。有人認(rèn)為“新一代”測(cè)序技術(shù)中的全外顯子測(cè)序（WES），對(duì)超聲檢測(cè)異常的胎兒進(jìn)行檢測(cè)，可以提高產(chǎn)前診斷水平[41]。除此之外，WES不僅可以明確胎兒結(jié)構(gòu)畸形的診斷[42]，還可以為腎臟發(fā)育異常提供病因診斷[43]。Chatterjee等[4]通過(guò)靶向的高通量測(cè)序揭示了GDNFRet/GFRa1途徑中存在罕見變異或新突變，它們將會(huì)導(dǎo)致RA等胚胎腎臟發(fā)育異常。最近，一個(gè)與RA有關(guān)的新候選基因GREB1L出現(xiàn)在人們的視野。有學(xué)者通過(guò)WES發(fā)現(xiàn)GREB1L上存在一個(gè)致病性（CADD=33）c.705G＞T錯(cuò)義突變，該基因突變將導(dǎo)致胎兒RA的發(fā)生[44]；隨后，有研究先通過(guò)WES鑒定出GREB1L中的12種雜合變體存在于家族性或單純性BRA病例中，通過(guò)原位雜交，顯示了GREB1L在發(fā)育中的小鼠腎臟生成區(qū)中表達(dá)，并且通過(guò)CRISPR-Cas9生成了GREB1L基因敲除小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性和雌性小鼠胚胎的腎臟發(fā)育異常[45]。

綜上所述，CNV-seq和WES等高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有：擴(kuò)大了染色體的檢測(cè)范圍，操作簡(jiǎn)便，并且對(duì)母胎安全性高等。若作為產(chǎn)前胎兒RA檢測(cè)手段，對(duì)其診斷及相關(guān)遺傳因素的尋找無(wú)疑是有利的。

5 小結(jié)和展望

產(chǎn)前超聲是應(yīng)作為孕婦妊娠期間胎兒RA篩查的常規(guī)手段，每個(gè)孕婦應(yīng)該定期行產(chǎn)前B超的檢查；若有RA疑似病例，產(chǎn)前B超無(wú)法確診時(shí)，可進(jìn)一步行MRI進(jìn)行確診；必要時(shí)若評(píng)估益處大于有害的情況時(shí)，可服用造影劑完善檢查。若影像學(xué)確診或懷疑胎兒RA，有需求的孕婦，可選擇高通量測(cè)序技術(shù)幫助診斷及病因的尋找。建議在專業(yè)婦產(chǎn)科醫(yī)生指導(dǎo)下，行CNV-seq尋找相應(yīng)致病或可能致病的拷貝數(shù)變異，若CNV-seq為陰性，可選擇WES檢測(cè)。從而幫助診斷和尋找相關(guān)的遺傳因素，完善產(chǎn)前管理并為下一次備孕做好相應(yīng)的遺傳咨詢，幫助醫(yī)務(wù)工作者作出個(gè)性化的防治決策。除此之外，CNV-seq和WES等高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)該廣泛用于基礎(chǔ)研究，有利于更好地找出RA相關(guān)遺傳因素的病因及相關(guān)機(jī)制。